La tecnologia NL-PEPTIDES DELIVERY™ come metodo innovativo per la creazione di peptidi di nuova generazione

Laboratori Synthagen

Tecnologia NL-PEPTIDES DELIVERY™ come metodo innovativo per la creazione di peptidi di nuova generazione . Confronto tra prestazioni e stabilità dei peptidi tradizionali e un metodo innovativo di sintesi peptidica e somministrazione orale. Riepilogo: Nella pratica, solo pochi peptidi tradizionali vengono utilizzati a causa della loro instabilità biologica e della rapida degradazione. La modificazione peptidica è la soluzione a questo problema, consentendo la creazione di forme peptidiche stabili ed efficaci. I peptidi di nuova generazione, sintetizzati utilizzando la tecnologia NL-PEPTIDES, sono incapsulati in una doppia capsula creata utilizzando il sistema NL-PEPTIDES DELIVERY™, massimizzando le prestazioni e la stabilità del peptide. Abbreviazioni: •AFP - Peptidi farmaceutici attivi •NL-PEPTIDES - Peptidi di nuova generazione •NL-PEPTIDES DELIVERY - Tecnologia di somministrazione orale Parole chiave: •peptide •legame peptidico •analogo •modifica •salting out •amidazione •acetilazione •sintesi •tecnologia •salting out •arginina

Introduzione

La tecnologia NL-PEPTIDES DELIVERY™, in quanto metodo innovativo, consente effetti terapeutici superiori a quelli dei peptidi tradizionali. L'efficacia di NL-PEPTIDES-DELIVERY™ è stata confermata sulla base di risposte a quesiti relativi alla produzione di peptidi, che raggiungono l'intestino intatti e vengono poi completamente assorbiti. L'innovativa tecnologia NL-PEPTIDES DELIVERY™ è protetta da brevetto come nuova forma di analoghi peptidici per lo sviluppo e la commercializzazione di peptidi orali con un sistema di somministrazione simultanea e specializzato.

COSA SONO I PEPTIDI TRADIZIONALI

In termini chimici tipici, i peptidi esistono in una forma non ramificata, possedendo solo due terminali specifici. Uno è chiamato terminale amminico, dove si trova un amminoacido con un gruppo α -amminico libero. L'altro è chiamato terminale carbossilico, o C-terminale, dove si trova un amminoacido con un gruppo α -carbossilico libero. I peptidi sono composti chimici composti da amminoacidi, simili alle proteine. Sono oggetto di ampio interesse e svolgono importanti funzioni biologiche. Molti ormoni e neurotrasmettitori sono peptidi. Nel caso dei peptidi endogeni, esercitano attività antimicrobica, agendo come sistema di difesa dell'organismo. I peptidi naturali sono considerati composti di interesse terapeutico per la loro elevata attività, la bassa tossicità e l'assenza di interazioni farmacologiche. Nella pratica medica, solo pochi peptidi vengono utilizzati a causa della loro instabilità biologica e della rapida degradazione. La soluzione al suddetto problema della stabilità dei peptidi è la loro sintesi, che consente la produzione di forme peptidiche stabili. Lo stesso vale per la sintesi di peptidi da fonti naturali, utilizzati, tra l'altro, per la produzione di vaccini.

LEGAMI PEPTIDICI

Il carbonio, a seguito della reazione del gruppo α -carbossilico, si lega all'azoto del gruppo α -amminico tramite un legame singolo, un legame peptidico. Si ritiene che questo legame formi due strutture che rimangono in uno specifico equilibrio tra loro. Il legame C-N si trasforma in un legame C=N e viceversa. La rotazione attorno all'asse C=N è impossibile, rendendo il legame peptidico così rigido da possedere le caratteristiche di un doppio legame. Gli amminoacidi che partecipano alla formazione del legame peptidico perdono frammenti molecolari. Questi sono molecole -OH dal gruppo carbossilico e -H dal gruppo amminico. Pertanto, gli amminoacidi presenti nei peptidi e nelle proteine ​​sono chiamati residui amminoacidici. I legami peptidici risultanti sono stabili e possono essere rotti solo dall'azione di basi e acidi forti ad alte temperature.

SINTESI DEI PEPTIDI

A seconda del peptide che vogliamo ottenere, abbiamo bisogno di un metodo di sintesi appropriato. In questa breve spiegazione, cercheremo di presentare la sintesi peptidica in relazione alle sue dimensioni. Per ottenere un dipeptide, è necessario utilizzare un reagente che attivi il gruppo carbossilico dell'amminoacido arilante o converta l'amminoacido acilante in un'anidride. La sintesi di peptidi più grandi, ottenuti da un dipeptide, è laboriosa e più difficile. Ciò comporta la rimozione della protezione del gruppo amminico dall'amminoacido N-terminale e l'acilazione con il successivo amminoacido N-protetto. Questo processo è particolarmente dispendioso in termini di tempo perché questi passaggi vengono ripetuti fino a ottenere un peptide con la sequenza pianificata. Per la preparazione di peptidi di grandi dimensioni, il metodo più efficace e semplice è il metodo Merifield. Questo metodo viene eseguito in fase solida . L'amminoacido C-terminale viene legato a un polimero, dove viene poi aggiunto l'amminoacido successivo fino a raggiungere la lunghezza di catena desiderata . 

ANALOGHI DEI PEPTIDI

In risposta alla natura instabile dei peptidi tradizionali, vengono progettati e prodotti i loro analoghi. Gli analoghi peptidici sono composti chimici che sostituiscono un atomo del composto originale con un altro. La struttura complessiva del peptide rimane invariata. Gli analoghi peptidici includono analoghi elicoidali e analoghi a β -piega e a β -foglietto . Nei primi, le eliche sono uno degli elementi strutturali chiave dei peptidi bioattivi. La stabilizzazione di brevi frammenti oligomerici in una conformazione elicoidale ne aumenta l'attività. Negli analoghi a β -piega e a β -foglietto, vengono inseriti residui di D-amminoacidi o β , γ e δ -amminoacidi . Gli analoghi peptidici ci consentono di ottenere nuovi composti peptidici più stabili, trovando contemporaneamente applicazioni in uno spettro più ampio di sintomi e consentendo soluzioni innovative ai problemi legati all'attività delle forme pre-analogiche esistenti.

ANALOGHI PEPTIDICI PER MODIFICAZIONE

I peptidi tradizionali, nonostante i loro innegabili e numerosi vantaggi, presentano anche numerose limitazioni legate alla loro applicazione. La ricerca di nuovi analoghi peptidici massimamente stabili e con un ampio spettro di attività è guidata dall'esistenza di peptidi tradizionali meno stabili. Gli analoghi dei peptidi tradizionali contenenti la sequenza chiave del peptide sono arricchiti con modifiche effettuate all'interno della catena peptidica o della catena laterale dei residui amminoacidici presenti nella sequenza. L'introduzione di amidazione e acetilazione contribuisce a migliorare la stabilità metabolica e la selettività. Esempi noti di modifiche, a seconda del profilo di attività del peptide, includono l'acetilazione dell'estremità N-terminale del peptide, la ciclizzazione, la marcatura con fluorofori, l'ammidazione dell'estremità C-terminale del peptide o degli amminoacidi D. 

PROCESSO DI SALT-OUT DEI PEPTIDI

Il processo di salting-out prevede la modifica delle cariche proteiche. Le cariche proteiche vengono neutralizzate da anioni e cationi salini. Le molecole proteiche non si attraggono e non formano aggregati, e la proteina stessa precipita a causa della perdita del suo involucro d'acqua. Il salting-out è un processo reversibile. Nel processo inverso, il sale viene rimosso tramite dialisi o la sua concentrazione viene ridotta mediante aggiunta di acqua. Il salting-out, attraverso l'aggiunta di una molecola di arginina, porta alla formazione di una forma stabile del peptide ed è un metodo innovativo per garantire la stabilità del peptide e, di conseguenza, estenderne l'attività biologica.

ACETILAZIONE E AMMIDAZIONE DEI PEPTIDI

L'acetilazione N-terminale dei peptidi comporta l'aggiunta di radicali acetilici a substrati contenenti gruppi NH2, OH o SH, tramite l'enzima N-acetiltransferasi. La fonte del radicale acetilico è l'acetil-CoA. La funzione principale delle N-acetiltransferasi è quella di facilitare l'attacco del gruppo acetile al gruppo amminico delle ammine aromatiche e delle idrazine (N-acetilazione), ovvero la detossificazione di composti esogeni potenzialmente tossici. Quando i legami peptidici vengono rotti, con conseguente frammentazione della catena polipeptidica, si formano gruppi carbonilici. L'ossidazione di una molecola proteica da parte del radicale idrossilico inizia con l'estrazione di un atomo di idrogeno dal carbonio α dell'amminoacido. Il radicale alchilico risultante reagisce con l'ossigeno per formare un radicale alchilperossido, che poi si trasforma in un alchilidroperossido. Il radicale alcossilico che si forma può essere trasformato in un residuo amminoacidico idrossilato al carbonio α o può portare alla frammentazione della catena polipeptidica. La presenza del radicale alcossilico promuove la frammentazione della catena polipeptidica. La scissione del legame peptidico può avvenire tramite α -amidazione o diamidazione. Il peptide N-terminale formato durante la frammentazione per α -amidazione presenta un gruppo ammidico al suo C-terminale, mentre il secondo peptide contiene un derivato N- α -chetoacilico al suo N-terminale . La frammentazione per diamidazione è caratterizzata dalla formazione di un peptide N-terminale contenente una struttura diammidica e di un peptide derivato dal C-terminale della molecola proteica contenente una struttura isocianato al suo N-terminale.

COSA SONO I NL-PEPTIDI™

In risposta alle sfide legate alla produzione di peptidi che raggiungano l'intestino intatti, abbiamo creato un gruppo di nuovi peptidi, chiamati NL-peptidi, noti anche come peptidi di nuova generazione, denominati AFP. Le caratteristiche di questi peptidi farmaceuticamente attivi riflettono i loro vantaggi rispetto ai peptidi tradizionali. Sono caratterizzati principalmente da una maggiore durata di conservazione e dalla resistenza alle variazioni di pH e temperatura, sia durante la conservazione del prodotto che nell'ambiente gastrointestinale, dove il peptide non si degrada durante l'ingestione della capsula e il trasporto nell'intestino tenue. Il gruppo dei NL-peptidi è caratterizzato dalla sua capacità di imitare le proteine ​​naturali e dall'elevata stabilità metabolica. Di conseguenza, i NL-peptidi, agendo come le proteine ​​naturali, vengono assorbiti intatti dall'intestino e non si degradano durante l'assorbimento.

FORMAZIONE DI NL-PEPTIDI ™ PER SINTESI

La rappresentazione chimica dei peptidi NL creati attraverso modifiche sintetiche sarà discussa di seguito. La tecnologia, che opera mediante la salatura del peptide con arginina, è stata ulteriormente migliorata dalla sintesi tramite N-acetilazione dell'estremità amminica del peptide con simultanea amidazione dell'estremità carbossilica. Tutti questi processi di modifica hanno portato a un aumento di dieci volte della stabilità dei peptidi NL e alla già citata capacità di imitare le proteine ​​naturali.  

TECNOLOGIA DI CONSEGNA NL-PEPTIDES ™

Nell'intraprendere il compito di creare una tecnologia moderna per la somministrazione orale di peptidi, è stato fondamentale affrontare le sfide, in primo luogo, di creare una tecnologia semplice basata sulla versatilità per un'ampia gamma di prodotti e, in secondo luogo, la produzione simultanea di diversi prodotti efficaci contemporaneamente, grazie a un metodo che consenta lo sviluppo di un sistema che consenta tale schema. I precedenti problemi legati all'assorbimento sono stati risolti utilizzando esclusivamente le suddette modifiche peptidiche. Nel nostro caso, oltre alla modifica peptidica, ci siamo concentrati sulla risoluzione dell'indubbiamente importante problema del trasporto del peptide, dalla somministrazione orale, attraverso il passaggio all'intestino tenue e, infine, all'assorbimento. La soluzione a queste sfide tecnologiche è lo sviluppo di una nuova, semplice ed efficace tecnologia di somministrazione peptidica, che chiamiamo NL-PEPTIDES-DELIVERY™.

PROFILO OPERATIVO DELLA TECNOLOGIA NL-PEPTIDES DELIVERY™

Il profilo d'azione, basato sulla tecnologia NL-PEPTIDES DELIVERY, consente principalmente al peptide di raggiungere l'intestino tenue attraverso un rivestimento appositamente creato che circonda il peptide NL. Oltre all'arrivo del peptide nell'intestino tenue, è importante che l'ambiente intestinale locale sia favorevole all'assorbimento del peptide lì trasportato. Questo problema era significativo a causa della presenza di enzimi che degradano i peptidi, le peptidasi, nell'intestino. I principali enzimi che degradano i peptidi sono enzimi proteolitici, chiamati proteasi, che impediscono al peptide di continuare il suo viaggio degradandolo nell'intestino tenue. Il fattore problematico, che abbiamo risolto, è lo scarso assorbimento del peptide stesso attraverso la parete dell'intestino tenue.

VANTAGGI DELLA TECNOLOGIA NL-PEPTIDES DELIVERY™

Concentrandosi sul profilo d'azione specifico della tecnologia NL-PEPTIDES DELIVERY™, si è sviluppato una nuova capsula a doppio strato con rivestimenti protettivi, che risolve il problema sia del raggiungimento dell'intestino tenue da parte del peptide, sia del suo passaggio attraverso la parete intestinale, nonché della sua degradazione. Il rivestimento protettivo, che costituisce la superficie più esterna della capsula, protegge il composto dalle variazioni di pH e dall'acidità gastrica, consentendo al peptide di raggiungere l'intestino. Incorporando un inibitore della proteasi nella capsula, il peptide esposto alla degradazione non viene degradato, abbassando contemporaneamente il pH intestinale locale e preparando il suo ambiente per l'assorbimento del peptide. È stato utilizzato un potenziatore dell'assorbimento per migliorare l'assorbimento del peptide da parte dell'intestino tenue. Il peptide NL è incapsulato in un rivestimento che lo separa dall'inibitore della proteasi. L'inibitore stesso è un acido che, se combinato con il peptide, potrebbe degradarlo. Separandolo dall'acido, utilizzando una capsula all'interno di un'altra capsula, abbiamo ottenuto una composizione farmaceutica stabile che non si degrada durante la conservazione.

FUNZIONAMENTO DELLA TECNOLOGIA NL-PEPTIDES DELIVERY™ NEL SISTEMA DIGERENTE

Questi peptidi di nuova generazione, sintetizzati utilizzando la tecnologia NL-PEPTIDES, sono incapsulati in una doppia capsula creata utilizzando il sistema NL-PEPTIDES DELIVERY™, che, una volta assunta per via orale, segue un percorso specifico attraverso l'apparato digerente. Una volta deglutita, la capsula raggiunge intatta l'intestino tenue, dove viene rilasciato un inibitore della proteasi, creando un ambiente di assorbimento idoneo abbassando il pH intestinale a 5,5. Nella fase successiva, il principio attivo e l'agente di assorbimento vengono rilasciati, consentendo al peptide di essere efficacemente assorbito dall'organismo.

RISULTATI DELL'UTILIZZO DELLA TECNOLOGIA NL-PEPTIDES DELIVERY™

La concentrazione del peptide nel sangue dopo l'ingestione della nostra doppia capsula è presentata nel grafico sottostante, dove il risultato ottenuto conferma chiaramente la presenza del peptide NL nel sangue. Questo indica il rilascio e l'assorbimento del peptide e, di conseguenza, la sua azione nell'organismo. I primi tre grafici di esempio mostrano i picchi peptidici ottenuti da campioni di sangue adeguatamente preparati, testati per un periodo di tempo specifico. Questi si riferiscono a NL-GHK-CU, NL-EPITHALON e NL-BPC-157 somministrati utilizzando la nostra tecnologia di rilascio brevettata NL-PEPTIDES-DELIVERY™, e ai peptidi standard GHK-CU, EPITHALON e ARG-BPC somministrati in capsule standard. I tre grafici successivi mostrano la distribuzione delle concentrazioni di peptidi nel sangue analizzato nell'intervallo di tempo 30-360 min, convertite in unità pg/ml. Confrontando i risultati della somministrazione orale sotto forma di doppia capsula con la somministrazione intranasale di peptidi, possiamo determinare la superiorità e l'efficacia di uno dei due metodi di somministrazione. Come mostrato nel grafico, la concentrazione di peptidi durante la somministrazione orale della nostra capsula è molto più elevata rispetto a quella durante la somministrazione intranasale. Le stesse dosi di peptide sono state utilizzate sia nella capsula che nello spray nasale. I risultati di questi studi evidenziano i vantaggi della nostra tecnologia rispetto alla somministrazione intranasale.

EFFETTO DEL LAVORO DEI LABORATORI SYNTHAGEN

Il compito che ci siamo prefissati prevedeva la creazione di una nuova tecnologia in grado di migliorare l'efficacia dei peptidi. La tecnologia di somministrazione orale di peptidi NL-PEPTIDES-DELIVERY si basa su un'innovativa terapia peptidica combinata con un nuovo metodo di somministrazione orale da noi sviluppato. La presentazione multicanale della nostra tecnologia, presentata in un formato di presentazione, consente una comprensione approfondita di ogni fase. Gli effetti del nostro lavoro possono essere visti nella presentazione