Peptidi con proprietà antimicrobiche e loro analoghi creati tramite modificazione.

Abstract: L'aumento osservato della resistenza agli antibiotici rappresenta attualmente una delle principali sfide che la medicina moderna deve affrontare. L'uso improprio e l'abuso dei farmaci disponibili ne hanno ridotto significativamente l'efficacia a causa dell'emergere di un numero crescente di microrganismi resistenti. Sono attualmente in corso ricerche per sviluppare agenti terapeutici più efficaci che colpiscano gli organismi patogeni, basati sui meccanismi di difesa naturali (peptidi antimicrobici) e sulle loro possibili modificazioni, ottenendo analoghi.

Parole chiave : peptidi antimicrobici; modifiche chimiche; ciclizzazione; coniugati di farmaci; lipidazione

Elenco delle abbreviazioni : AMP – peptidi antimicrobici

Il concetto di resistenza ai farmaci

La farmacoresistenza è un concetto che si riferisce alla resistenza di patogeni e parassiti ai farmaci. Ciò significa che questi patogeni hanno la capacità di sopravvivere e riprodursi in presenza di un farmaco che dovrebbe distruggerli o inibirli, ma ciò non accade. La farmacoresistenza può essere divisa in due tipi: innata e acquisita. Mentre la prima è una caratteristica tipicamente associata ai microbi, la resistenza acquisita deriva dall'esposizione a un farmaco attraverso alterazioni del loro DNA, che si traducono in farmacoresistenza.

Peptidi con proprietà antimicrobiche - caratteristiche

I peptidi antimicrobici (AMP) sono un gruppo di composti composti da 10 a 50 residui amminoacidici. La carica netta, compresa tra +2 e +9, è dovuta alla presenza di residui di L-arginina, L-lisina o L-istidina nella catena peptidica. La sintesi di AMP può avvenire in due modi. Il primo avviene tramite la traduzione ribosomiale dell'mRNA, che avviene in tutti gli organismi, mentre il secondo avviene tramite la sintesi di peptidi non ribosomiali, principalmente nei batteri. I peptidi sintetizzati tramite sintesi non ribosomiale, come gli antibiotici a base di polimixina e gramicidina S, sono ampiamente utilizzati per la loro attività antimicrobica. Tuttavia, i peptidi prodotti tramite sintesi ribosomiale sono sempre più utilizzati per le loro proprietà di stimolazione dell'immunità innata. I peptidi antimicrobici sono isolati da vari organismi (Fig. 1).

Figura 1. Organismi da cui sono stati isolati i peptidi antimicrobici (AMP)

Defensine come AMP animali

La maggior parte dei peptidi antimicrobici è stata isolata da pesci, anfibi e mammiferi. I numeri più elevati sono stati osservati nei fagociti, nei neutrofili, nei macrofagi e nelle secrezioni delle cellule epiteliali. Le defensine sono tra i composti con la maggiore attività biocida, grazie alla loro capacità di modulare la risposta immunitaria dell'ospite. Le defensine sono peptidi antimicrobici anfipatici ricchi di residui amminoacidici basici e L-cisteina, presenti in animali e piante. La loro attività biocida ha come bersaglio un'ampia gamma di batteri e funghi Gram-positivi e Gram-negativi. Si distinguono tre classi di defensine: α-, β- e θ-, che differiscono nella topologia dei loro ponti disolfuro (Fig. 2).

Figura 2. Tre classi fondamentali di defensine presenti nell'ambiente

Le α-defensine più note sono HNP1-4, prodotte principalmente nella placenta, nella cervice e nella mucosa intestinale; i composti HD5 e HD6 presenti nelle ghiandole salivari, nella parete del tratto gastrointestinale, nel tratto urinario e nella mucosa oculare; e NP5 presente nelle cellule di Paneth. Le β-defensine costituiscono la classe di AMP più diversificata, essendo quella con l'evoluzione più lunga e essendo state rilevate nel materiale genetico di tutti i vertebrati classificati fino ad oggi. Tra le più recenti scoperte ci sono le θ-defensine, che includono i peptidi RTD1-3. Le defensine mostrano un ampio spettro di attività antimicrobica, partecipando attivamente alla difesa immunitaria degli organismi; ad esempio, l'α-defensina umana HD5 elimina efficacemente le infezioni causate da Salmonella typhimurium e Staphylococcus aureus, mentre RTD-1 mostra attività biocida contro Escherichia coli.

Peptidi AMP di origine vegetale

I peptidi antimicrobici sono presenti in tutte le specie vegetali. Una caratteristica degli AMP vegetali è la presenza di residui di L-cisteina e di diversi ponti disolfuro, che contribuiscono a mantenere una struttura compatta e a fornire resistenza proteolitica e chimica. Gli AMP vegetali, che includono specificamente tionine, defensine e cicloidi, sono composti da 45-47 residui amminoacidici per catena. Si distinguono due sottogruppi di tionine: 8c, che contengono otto residui di L-cisteina nella sequenza e formano quattro ponti disolfuro, e 6c, che contengono sei di tali residui e tre legami -SS.

Peptidi con proprietà antimicrobiche - proprietà

I peptidi antimicrobici vengono utilizzati sempre più spesso e con successo come metodo innovativo per il trattamento della resistenza ai farmaci. Hanno dimostrato un'elevata attività contro batteri, virus e funghi Gram-negativi e Gram-positivi. Inoltre, i peptidi con proprietà antimicrobiche hanno la capacità di neutralizzare le tossine batteriche, inibire le reazioni proinfiammatorie e la formazione di biofilm e accelerare la guarigione delle ferite.

Meccanismo di ingresso dell'AMP nella cellula

Gli AMP possono penetrare nelle cellule batteriche attraverso una varietà di meccanismi. Nella stragrande maggioranza dei casi, le membrane cellulari microbiche vengono disintegrate durante il processo di lisi, mediato da interazioni elettrostatiche e idrofobiche tra frammenti carichi positivamente di residui di L-arginina o L-lisina e aree caricate negativamente delle membrane batteriche. Esistono tre modelli principali di penetrazione dei peptidi antimicrobici attraverso gli involucri microbici esterni: a doga di botte, a tappeto e toroidale (Fig. 3).

Figura 3. Diagramma schematico dei meccanismi di disintegrazione della membrana cellulare da parte dell'AMP: a) modello a botte-doga, b) modello a tappeto, c) modello toroidale

a) Il modello a doga di botte si basa sull'interazione di peptidi α-elicoidali anfipatici con la membrana batterica, formando canali transmembrana o pori con segmenti idrofilici diretti verso l'interno. Ciò fa sì che l'AMP venga incorporato verticalmente nello scheletro lipidico della membrana e interrompa il potenziale transmembrana e il gradiente ionico. Di conseguenza, la sintesi di ATP viene inibita e la permeabilità della membrana aumenta, portando a rigonfiamento cellulare e osmosi. b) Il modello a tappeto prevede il legame di un peptide alla membrana e la formazione di un "tappeto" sulla sua superficie. Le catene peptidiche si dispongono all'esterno della membrana in modo che le loro regioni idrofile siano rivolte verso i frammenti fosfolipidici idrofili e le loro regioni idrofobiche siano rivolte verso il nucleo della membrana. A causa delle interazioni elettrostatiche, i frammenti carichi positivamente della catena peptidica AMP si legano ai fosfolipidi carichi negativamente, limitando la permeabilità della membrana attraverso la struttura a tappeto peptidico, e quindi la membrana viene distrutta, formando infine strutture micellari. c) Il modello del poro toroidale si basa sul fatto che gli AMP si aggregano sulla superficie del doppio strato lipidico, provocandone la piegatura verso l'interno. Le regioni idrofile della catena peptidica si legano alle teste polari dei lipidi di membrana, determinando la disintegrazione della membrana e la formazione di pori più grandi di quelli del modello a doghe di botte.

Esempi di modifiche chimiche dell'AMP

Nonostante i loro numerosi vantaggi, i peptidi antimicrobici presentano anche numerose limitazioni legate al loro utilizzo. Di conseguenza, vengono progettati analoghi sintetici contenenti la sequenza chiave per l'attività antimicrobica o basati su AMP nativi. Di seguito alcuni esempi:

1. Ciclizzazione

Sono noti quattro tipi di ciclizzazione della catena peptidica degli AMP naturali: tra il frammento N- e C-terminale della catena, l'estremità N- o C-terminale della catena peptidica e il gruppo funzionale situato nella catena laterale di uno degli amminoacidi presenti nella sequenza e all'interno delle catene laterali stesse (Fig. 4). L'effetto di questi processi è quello di migliorare la stabilità del peptide, che si traduce in una maggiore resistenza alla degradazione da parte degli enzimi proteolitici. Gli analoghi dell'AMP ottenuti mediante modifica della ciclizzazione hanno mostrato proprietà quali: maggiore attività antimicrobica contro i ceppi di Escherichia coli e Bacillus subtilis, attività biocida contro batteri gram-positivi (vari ceppi di Staphylococcus aureus ed Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Corynebacterium bovis) e batteri gram-negativi (Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Salmonella enteritidis, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae) e l'uso di questo analogo dell'AMP nelle ustioni cutanee, nella cura delle ferite postoperatorie e nella prevenzione delle infezioni.

Figura 4. Un esempio di modifica dell'AMP che è la ciclizzazione

2. Coniugati di farmaci

Un altro tipo di modifica chimica dell'AMP è il legame covalente con gli antibiotici, che ne migliora l'attività antimicrobica e riduce la dose terapeutica del farmaco, eliminando così il verificarsi di effetti avversi. Gli analoghi dell'AMP creati tramite modifica come coniugati di farmaci hanno dimostrato proprietà quali una maggiore attività antimicrobica contro i ceppi di Escherichia coli e Bacillus subtilis, attività biocida contro i batteri Gram-positivi, assenza di tossicità per le cellule epiteliali e gli eritrociti umani, attività biocida contro i ceppi di stafilococco e utilizzo dell'analogo nel trattamento della polmonite acquisita in comunità, della sinusite batterica acuta e della pielonefrite.

3. Lipidazione

Una delle modifiche post-traduzionali più importanti è la lipidazione, che, oltre a regolare la funzione di peptidi e proteine, ne aumenta anche l'affinità per le membrane cellulari. L'uso di analoghi progettati è determinato dal numero e dal tipo di acidi grassi legati e dalla lunghezza delle catene carboniose. L'incorporazione di gruppi lipidici nelle catene peptidiche consente, tra le altre cose, di modificare la solubilità in acqua dei composti di nuova sintesi, la loro capacità di autoassemblarsi e la loro stabilità termica. Gli analoghi dell'AMP ottenuti per lipidazione hanno mostrato proprietà come una maggiore attività antimicrobica contro batteri Gram-positivi (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis, Enterococcus Faecalis), batteri Gram-negativi (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa) e funghi (Candida albicans, Candida tropicalis e Aspergillus brasiliensis).

Riepilogo

Uno dei problemi più significativi che la medicina moderna deve affrontare è l'uso frequente di antibiotici, che porta allo sviluppo di nuove specie di microrganismi resistenti. Un modo per affrontare questo problema crescente potrebbe essere l'uso di peptidi antimicrobici, componenti del sistema immunitario innato dell'organismo. Gli AMP sono spesso definiti come composti caricati positivamente con una struttura anfipatica, che modula le loro proprietà antimicrobiche contro un'ampia gamma di batteri, virus e funghi. Gli elevati costi di produzione e la limitata biodisponibilità degli AMP naturali hanno reso necessaria la ricerca di nuovi composti modello la cui azione si basi su meccanismi già noti.

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