Peptidi con proprietà antimicrobiche e i loro analoghi ottenuti mediante modifiche.

Riassunto: L’aumento osservato della resistenza agli antibiotici è attualmente uno dei principali problemi della medicina moderna. L’uso inappropriato e l’abuso dei preparati disponibili hanno causato un significativo indebolimento della loro efficacia a causa della comparsa di un numero sempre maggiore di microrganismi resistenti. Attualmente sono in corso studi volti a sviluppare mezzi terapeutici più efficaci che agiscano sugli organismi patogeni secondo meccanismi di difesa presenti in natura (peptidi antimicrobici) e le loro possibili modifiche, ottenendo analoghi di questi peptidi.

Parole chiave: peptidi antimicrobici; modifiche chimiche; ciclizzazione; coniugati con farmaci; lipidazione

Elenco delle abbreviazioni: AMP – peptidi antimicrobici

Concetto di resistenza ai farmaci

La resistenza ai farmaci è un concetto che si riferisce alla capacità di patogeni e parassiti di resistere all’azione dei farmaci. Ciò significa che questi patogeni sono in grado di vivere e riprodursi in presenza del farmaco, che dovrebbe invece distruggerli o inibirli, ma ciò non avviene. La resistenza ai farmaci può essere suddivisa in due tipi: resistenza innata e acquisita. La prima è una caratteristica tipica dei microbi, mentre la resistenza acquisita è il risultato del contatto con il farmaco, attraverso una modifica del proprio materiale genetico, che porta allo sviluppo della resistenza al farmaco.

Peptidi con proprietà antimicrobiche - caratteristiche

I peptidi con proprietà antimicrobiche (AMP) sono un gruppo di composti costituiti da 10 a 50 residui amminoacidici. La carica risultante, compresa tra +2 e +9, deriva dalla presenza di residui di L-arginina, L-lisina o L-istidina nella catena peptidica. La sintesi degli AMP può avvenire in due modi. Il primo avviene tramite la traduzione ribosomiale dell’mRNA, presente in tutti gli organismi, mentre il secondo avviene tramite la sintesi non ribosomiale dei peptidi, effettuata principalmente dai batteri. I peptidi sintetizzati tramite la sintesi non ribosomiale, come gli antibiotici a base di polimixine e gramicidina S, trovano ampio impiego per la loro azione antimicrobica. Sempre più spesso, tuttavia, a causa delle loro proprietà che stimolano l’immunità innata, trovano applicazione i peptidi prodotti dalla sintesi ribosomiale. I peptidi antimicrobici vengono isolati da diversi organismi.

Defensine come AMP animali

La maggior parte dei peptidi antimicrobici è stata isolata da pesci, anfibi e mammiferi. La maggior concentrazione si osserva nei fagociti, neutrofili, macrofagi e nelle secrezioni delle cellule epiteliali. Tra i composti con la maggiore attività biocida vi sono le defensine, grazie alle loro proprietà che permettono di modulare la risposta immunitaria dell’organismo ospite. Le defensine sono peptidi antimicrobici anfipatici, ricchi di residui amminoacidici basici e L-cisteina, presenti negli organismi animali e vegetali. La loro attività biocida è diretta verso un’ampia gamma di batteri Gram-positivi, Gram-negativi e funghi. Si distinguono tre classi di defensine: α-, β- e θ-, che differiscono tra loro per la topologia dei ponti disolfuro.

Le α-defensine più note sono: HNP1-4, prodotte principalmente nella placenta, nella cervice uterina e nella mucosa intestinale; i composti HD5 e HD6, presenti nelle ghiandole salivari, nella parete del tratto gastrointestinale, urinario e nella mucosa oculare; e NP5, presenti nelle cellule di Paneth. Le β-defensine rappresentano la classe più diversificata di AMP, a causa della loro più lunga evoluzione, essendo state rilevate nel materiale genetico di tutti i vertebrati finora classificati. Le θ-defensine, scoperte più recentemente, comprendono i peptidi RTD1-3. Le defensine mostrano un ampio spettro di attività antimicrobica, partecipando attivamente alla difesa immunitaria degli organismi; ad esempio, l’α-defensina umana HD5 elimina efficacemente le infezioni causate da Salmonella typhimurium e Staphylococcus aureus, mentre RTD-1 mostra attività biocida contro Escherichia coli.

Peptidi AMP vegetali

I peptidi antimicrobici si trovano in tutte le specie vegetali. Una caratteristica distintiva degli AMP vegetali è la presenza di residui di L-cisteina e di diversi ponti disolfuro, che contribuiscono a mantenere una struttura compatta, garantendo resistenza alla degradazione proteolitica e chimica. Gli AMP vegetali, tra cui in particolare tionine, defensine e cicloidi, sono costituiti da 45 a 47 residui amminoacidici nella catena. Si distinguono due sottogruppi di tionine: 8c, che possiedono otto residui di L-cisteina nella sequenza e formano quattro ponti disolfuro, e 6c, che ne possiedono sei e formano tre legami -S-S.

Peptidi con proprietà antimicrobiche - proprietà

Come metodo innovativo per il trattamento della resistenza ai farmaci, i peptidi antimicrobici sono sempre più utilizzati con successo. Essi mostrano alta attività contro batteri Gram-negativi e Gram-positivi, virus e funghi. Inoltre, i peptidi con proprietà antimicrobiche sono in grado di neutralizzare le tossine batteriche, inibire le reazioni proinfiammatorie e la formazione di biofilm, e accelerare la guarigione delle ferite.

Meccanismo di penetrazione degli AMP nella cellula

La penetrazione degli AMP all’interno delle cellule batteriche può avvenire attraverso diversi meccanismi. Nella maggior parte dei casi si verifica la disintegrazione delle membrane cellulari dei microrganismi tramite lisi, grazie a interazioni elettrostatiche e idrofobiche tra le parti caricate positivamente dei residui di L-arginina o L-lisina e le aree della membrana batterica caricate negativamente. Si distinguono tre modelli principali di penetrazione dei peptidi antimicrobici attraverso gli involucri esterni dei microrganismi: modello a fessure a botte, modello a tappeto e modello a pori toroidali.

a) Il modello a fessure a botte si basa sull’interazione di peptidi anfipatici con struttura α-elicoidale con la membrana batterica, formando canali transmembrana o pori con frammenti idrofili rivolti verso l’interno. Ciò provoca l’inserimento verticale degli AMP nella struttura lipidica della membrana e l’alterazione del potenziale transmembrana e del gradiente ionico. Questi fenomeni inibiscono la sintesi di ATP e aumentano la permeabilità della membrana, portando a gonfiore cellulare e osmosi;

b) Il modello a tappeto consiste nel legame del peptide con la membrana e nella formazione di un “tappeto” sulla sua superficie. Le catene peptidiche si dispongono all’esterno della membrana in modo che le regioni idrofile siano rivolte verso le parti idrofile dei fosfolipidi, mentre quelle idrofobe verso il nucleo della membrana. Grazie alle interazioni elettrostatiche, le parti caricate positivamente della catena peptidica AMP si legano ai fosfolipidi carichi negativamente, limitando la permeabilità della membrana tramite la struttura del tappeto peptidico, che infine porta alla distruzione della membrana e alla formazione di strutture micellari;

c) Il modello a pori toroidali si basa sull’aggregazione degli AMP sulla superficie del doppio strato lipidico, causando la sua piegatura verso l’interno. Le regioni idrofile della catena peptidica si legano alle teste polari dei lipidi della membrana, portando alla disintegrazione della membrana e alla formazione di pori di dimensioni maggiori rispetto al modello a fessure a botte.

Esempi di modifiche chimiche degli AMP

Nonostante i numerosi vantaggi, i peptidi antimicrobici presentano anche molte limitazioni legate al loro impiego, per cui si progettano analoghi sintetici contenenti la sequenza chiave per l’azione antimicrobica o basati sugli AMP nativi. Di seguito presentiamo alcuni esempi:

1. Ciclizzazione

Sono noti quattro tipi di ciclizzazione della catena peptidica degli AMP naturali: tra il frammento N-terminale e C-terminale della catena, tra l’estremità N o C della catena peptidica e un gruppo funzionale situato nella catena laterale di uno degli amminoacidi presenti nella sequenza, e all’interno delle stesse catene laterali (Fig.4). Questi processi migliorano la stabilità del peptide, aumentando la resistenza alla degradazione da parte degli enzimi proteolitici. Gli analoghi AMP ottenuti tramite ciclizzazione hanno mostrato proprietà quali: aumento dell’attività antimicrobica contro ceppi di Escherichia coli e Bacillus subtilis, azione biocida contro batteri Gram-positivi (diversi ceppi di Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Corynebacterium bovis) e Gram-negativi (Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Salmonella enteritidis, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae), e utilizzo di questi analoghi AMP per ustioni cutanee, cura delle ferite postoperatorie e prevenzione delle infezioni.

2. Coniugati con farmaci

Un altro tipo di modifica chimica degli AMP è il legame covalente con antibiotici, che migliora la loro azione antimicrobica e riduce la dose terapeutica del farmaco, eliminando così gli effetti indesiderati. Gli analoghi AMP ottenuti tramite coniugazione con farmaci hanno mostrato proprietà quali: aumento dell’attività antimicrobica contro ceppi di Escherichia coli e Bacillus subtilis, azione biocida contro batteri Gram-positivi, assenza di tossicità per le cellule epiteliali e gli eritrociti umani, azione biocida contro ceppi di stafilococchi e utilizzo dell’analogo nel trattamento della polmonite acquisita in comunità, della sinusite batterica acuta e della pielonefrite.

3. Lipidazione

Una delle modifiche post-traduzionali più importanti è la lipidazione, che oltre a regolare le funzioni di peptidi e proteine, aumenta la loro affinità per le membrane cellulari. L’uso di analoghi progettati dipende dalla quantità e dal tipo di acidi grassi legati e dalla lunghezza delle catene di carbonio. L’inserimento di gruppi lipidici nelle catene peptidiche consente, tra l’altro, di modificare la solubilità in acqua dei nuovi composti sintetizzati, la loro capacità di auto-organizzazione e la stabilità termica. Gli analoghi AMP ottenuti tramite lipidazione hanno mostrato proprietà quali: aumento dell’attività antimicrobica contro batteri Gram-positivi (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis), Gram-negativi (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa) e funghi (Candida albicans, Candida tropicalis e Aspergillus brasiliensis).

Conclusione

Uno dei problemi rilevanti della medicina moderna è l’uso frequente di antibiotici, che porta alla formazione di nuove specie di microrganismi resistenti. Un modo per eliminare questo problema crescente potrebbe essere l’impiego di peptidi antimicrobici, che fanno parte del sistema immunitario innato dell’organismo. Il termine AMP si riferisce solitamente a composti con carica positiva e struttura anfipatica, responsabili della modulazione delle loro proprietà antimicrobiche contro un’ampia gamma di batteri, virus e funghi. Gli elevati costi di produzione e la limitata biodisponibilità degli AMP naturali hanno reso necessaria la ricerca di nuovi composti modello, la cui azione si basa sui meccanismi finora conosciuti.

Bibliografia

1. Veltri D, Kamath U, Shehu A, Deep learning improves antimicrobial peptide recognition. 2018; Bioinformatics 34: 2740–2747;

2. Manzini MC, Perez KR, Riske KA, Bozelli JC Jr, Santos TL, da Silva MA, Saraiva GK, Politi MJ, Valente AP, Almeida FC, Chaimovich H, Rodrigues, Peptide : lipid ratio and membrane surface charge determine the mechanism of action of the antimicrobial peptide BP100. 2014; Conformational and functional studies. Biochim Biophys Acta 1838: 1985–1999

3. Agrawal P, Raghava GPS, Prediction of antimicrobial potential of a chemically modified peptide from its tertiary structure. 2018, Front Microbiol 9: 2551; doi: 10.3389/fmicb.2018.02551

4. Usmani SS, Bedi G, Samuel JS, Singh S, Kalra S, Kumar P, et al, THPdb: database of FDA-approved peptide and protein therapeutics. 2017; doi: 10.1371/journal.pone.0181748

5. Xiao Y, Hughes AL, Ando J, Matsuda Y, Cheng JF, Skinner-Noble D, Zhang, A genome-wide screen identifies a single β-defensin gene cluster in the chicken: implications for the origin and evolution of mammalian defensins. 2014; BMC Genomics 5: 56; doi: 10.1186/1471-2164-5-56