NL-PEPTIDES DELIVERY™-Technologie als innovative Methode zur Herstellung von Peptiden der neuen Generation

Synthagen Laboratories

NL-PEPTIDES DELIVERY™-Technologie als innovative Methode zur Herstellung von Peptiden der neuen Generation Vergleich der Wirkung und Wirkungsdauer traditioneller Peptide gegenüber einer innovativen Methode der Peptidsynthese und oralen Verabreichung. Zusammenfassung: Aufgrund ihrer biologischen Instabilität und ihres schnellen Abbaus finden herkömmliche Peptide in der Praxis nur selten Anwendung. Die Modifizierung von Peptiden bietet hier eine Lösung und ermöglicht die Herstellung stabiler und wirksamer Peptidformen. Mithilfe der NL-PEPTIDES-Technologie synthetisierte Peptide der neuen Generation werden in einer Doppelkapsel verkapselt, die mit dem NL-PEPTIDES DELIVERY™-System hergestellt wird. Dies maximiert die Wirksamkeit und Stabilität der Peptide. Abkürzungsverzeichnis: •AFP – Aktive pharmazeutische Peptide •NL-Peptide – Peptide der neuen Generation •NL-Peptide-Verabreichung – Orale Verabreichungstechnologie Schlüsselwörter: • Peptid • Peptidbindung • Analogon • Modifikation • Aussalzen • Amidierung • Acetylierung • Synthese • Technologie • Aussalzen • Arginin

Einführung

Die innovative NL-PEPTIDES DELIVERY™-Technologie ermöglicht therapeutische Effekte, die über die von herkömmlichen Peptiden hinausgehen. Die Wirksamkeit von NL-PEPTIDES DELIVERY™ wurde durch die Beantwortung von Fragen zur Herstellung von Peptiden bestätigt, die intakt den Darm erreichen und dort vollständig resorbiert werden. Die innovative NL-PEPTIDES DELIVERY™-Technologie ist patentrechtlich geschützt und stellt eine neue Form von Peptidanaloga für die Entwicklung und Vermarktung oraler Peptide mit einem simultanen, spezialisierten Verabreichungssystem dar.

WAS SIND TRADITIONELLE PEPTIDE?

Chemisch betrachtet liegen Peptide in unverzweigter Form vor und besitzen nur zwei spezifische Enden. Das eine wird als Amino-Terminus bezeichnet, an dem eine Aminosäure mit einer freien α -Aminogruppe vorkommt. Das andere wird als Carboxyl-Terminus oder C-Terminus bezeichnet, an dem eine Aminosäure mit einer freien α -Carboxylgruppe vorkommt. Peptide sind chemische Verbindungen aus Aminosäuren, ähnlich wie Proteine. Sie sind Gegenstand vielfältigen Interesses und erfüllen wichtige biologische Funktionen. Viele Hormone und Neurotransmitter sind Peptide. Endogene Peptide wirken antimikrobiell und sind Teil des körpereigenen Abwehrsystems. Natürlich vorkommende Peptide gelten aufgrund ihrer hohen Aktivität, geringen Toxizität und fehlenden Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten als attraktive therapeutische Wirkstoffe. In der medizinischen Praxis werden jedoch nur wenige Peptide aufgrund ihrer biologischen Instabilität und ihres schnellen Abbaus eingesetzt. Die Lösung für dieses Problem der Peptidstabilität liegt in ihrer Synthese, die die Herstellung stabiler Peptidformen ermöglicht. Gleiches gilt für die Synthese von Peptiden aus natürlichen Quellen, die unter anderem in der Impfstoffproduktion Verwendung finden.

PEPTIDBINDUNGEN

Durch die Reaktion der α -Carboxylgruppe bindet Kohlenstoff über eine Einfachbindung, die Peptidbindung, an den Stickstoff der α -Aminogruppe. Man geht davon aus, dass diese Bindung zwei Strukturen bildet, die sich in einem spezifischen Gleichgewicht befinden. Die C-N-Bindung wandelt sich in eine C=N-Bindung um und umgekehrt. Eine Drehung um die C=N-Achse ist unmöglich, wodurch die Peptidbindung so starr ist, dass sie die Eigenschaften einer Doppelbindung aufweist. Aminosäuren, die an der Peptidbindung beteiligt sind, verlieren Molekülfragmente. Dabei handelt es sich um -OH-Moleküle der Carboxylgruppe und -H-Moleküle der Aminogruppe. Daher werden die in Peptiden und Proteinen vorkommenden Aminosäuren als Aminosäurereste bezeichnet. Die entstehenden Peptidbindungen sind stabil und können nur durch Einwirkung starker Basen und Säuren bei hohen Temperaturen gespalten werden.

PEPTIDSYNTHESE

Abhängig vom gewünschten Peptid benötigen wir eine geeignete Synthesemethode. In dieser kurzen Erklärung wird die Peptidsynthese in Bezug auf ihre Größe dargestellt. Zur Synthese eines Dipeptids muss ein Reagenz verwendet werden, das die Carboxylgruppe der arylierenden Aminosäure aktiviert oder die acylierende Aminosäure in ein Anhydrid umwandelt. Die Synthese größerer Peptide, ausgehend von einem Dipeptid, ist arbeitsintensiv und aufwendiger. Hierbei wird die Aminoschutzgruppe der N-terminalen Aminosäure abgespalten und diese mit der nächsten N-geschützten Aminosäure acyliert. Dieser Prozess ist besonders zeitaufwendig, da diese Schritte so lange wiederholt werden müssen, bis ein Peptid mit der gewünschten Sequenz erhalten ist. Für die Herstellung großer Peptide ist die Merifield-Methode die effektivste und einfachste. Diese Methode wird in der Festphase durchgeführt . Die C-terminale Aminosäure wird an ein Polymer gebunden, an das dann die nächste Aminosäure angefügt wird, bis die gewünschte Kettenlänge erreicht ist . 

PEPTIDANALOGE

Aufgrund der Instabilität traditioneller Peptide werden deren Analoga entwickelt und hergestellt. Peptidanaloga sind chemische Verbindungen, bei denen ein Atom der ursprünglichen Verbindung durch ein anderes ersetzt wird. Die Gesamtstruktur des Peptids bleibt dabei unverändert. Zu den Peptidanaloga zählen Helix-Analoga sowie β -Faltblatt- und β -Schleifen -Analoga . Bei den Helix-Analoga ist die Helixstruktur ein Schlüsselelement bioaktiver Peptide. Die Stabilisierung kurzer Oligomerfragmente in einer Helixkonformation erhöht die Aktivität. Bei β -Faltblatt- und β- Schleifen-Analoga werden D-Aminosäuren oder β- , γ- und δ -Aminosäurereste eingefügt . Peptidanaloga ermöglichen die Gewinnung neuer, stabilerer Peptidverbindungen, die gleichzeitig ein breiteres Anwendungsspektrum bei verschiedenen Symptomen ermöglichen und innovative Lösungen für Probleme im Zusammenhang mit der Aktivität bestehender Präanaloga bieten.

PEPTIDANALOGE DURCH MODIFIKATION

Traditionelle Peptide weisen trotz ihrer unbestreitbaren und zahlreichen Vorteile auch viele Anwendungsbeschränkungen auf. Die Suche nach neuen, maximal stabilen Peptidanaloga mit einem breiten Wirkungsspektrum wird durch die Existenz weniger stabiler traditioneller Peptide vorangetrieben. Analoga traditioneller Peptide, die die Schlüsselsequenz des Peptids enthalten , werden durch Modifikationen innerhalb der Peptidkette oder der Seitenketten von Aminosäureresten angereichert. Die Einführung von Amidierung und Acetylierung trägt zu verbesserter metabolischer Stabilität und Selektivität bei.  Bekannte Beispiele für Modifikationen, die vom Aktivitätsprofil des Peptids abhängen, sind die Acetylierung des N-Terminus des Peptids, die Cyclisierung, die Markierung mit Fluorophoren, die Amidierung des C-Terminus des Peptids oder von D-Aminosäuren. 

PEPTID-SALZVERFAHREN

Beim Aussalzen werden die Ladungen von Proteinen verändert. Diese Ladungen werden durch Anionen und Kationen des Salzes neutralisiert. Die Proteinmoleküle ziehen sich nicht mehr gegenseitig an und bilden keine Aggregate. Durch den Verlust der Wasserhülle fällt das Protein aus. Das Aussalzen ist ein reversibler Prozess. Im umgekehrten Verfahren wird das Salz durch Dialyse entfernt oder seine Konzentration durch Zugabe von Wasser reduziert. Durch die Zugabe eines Argininmoleküls führt das Aussalzen zur Bildung einer stabilen Peptidform und ist eine innovative Methode zur Sicherstellung der Peptidstabilität und damit zur Verlängerung der biologischen Aktivität von Peptiden.

PEPTIDACETYLIERUNG UND AMIDIERUNG

Die N-terminale Acetylierung von Peptiden beruht auf der Anlagerung von Acetylradikalen an Substrate mit NH₂-, OH- oder SH-Gruppen durch das Enzym N-Acetyltransferase. Acetyl-CoA dient als Quelle für das Acetylradikal. Die Hauptfunktion der N-Acetyltransferasen besteht in der Anlagerung der Acetylgruppe an die Aminogruppe aromatischer Amine und Hydrazine (N-Acetylierung), d. h. in der Entgiftung potenziell toxischer exogener Verbindungen. Bei der Spaltung von Peptidbindungen und der damit einhergehenden Fragmentierung der Polypeptidkette entstehen Carbonylgruppen. Die Oxidation eines Proteinmoleküls durch ein Hydroxylradikal beginnt mit der Abspaltung eines Wasserstoffatoms vom α -Kohlenstoffatom der Aminosäure. Das entstehende Alkylradikal reagiert mit Sauerstoff zu einem Alkylperoxidradikal, welches sich anschließend in ein Alkylhydroperoxid umwandelt. Das resultierende Alkoxyradikal kann entweder in einen am α - Kohlenstoffatom hydroxylierten Aminosäurerest übergehen oder zur Fragmentierung der Polypeptidkette führen. Die Anwesenheit eines Alkoxyradikals fördert die Fragmentierung der Polypeptidkette. Die Spaltung von Peptidbindungen kann über α -Amidierung oder Diamidierung erfolgen. Das bei der α -Amid-Fragmentierung entstehende N-terminale Peptid besitzt eine Amidgruppe am C-Terminus, während das zweite Peptid ein N- α - Ketoacylderivat am N-Terminus aufweist . Die Fragmentierung über den Diamidweg ist durch die Bildung eines N-terminalen Peptids mit einer Diamidstruktur und eines vom C-Terminus des Proteinmoleküls abgeleiteten Peptids mit einer Isocyanatstruktur am N-Terminus gekennzeichnet.

WAS SIND NL-PEPTIDE™?

Als Antwort auf die Probleme im Zusammenhang mit der Herstellung von Peptiden, die den Darm intakt erreichen, haben wir eine Gruppe neuer Peptide entwickelt, die NL-Peptide genannt werden, auch bekannt als Peptide der neuen Generation, abgekürzt AFP. Die Eigenschaften pharmazeutisch aktiver Peptide spiegeln ihre Vorteile gegenüber herkömmlichen Peptiden wider. Sie zeichnen sich vor allem durch eine verlängerte Haltbarkeit aus und Beständigkeit gegenüber pH-Wert- und Temperaturschwankungen, sowohl während der Lagerung des Produkts als auch im Milieu des Verdauungssystems, wo das Peptid beim Einnehmen der Kapsel und beim Transport in den Dünndarm nicht abgebaut wird. Die NL-Peptidgruppe zeichnet sich durch die Fähigkeit aus, natürlich vorkommende Proteine ​​nachzuahmen, und durch eine hohe metabolische Stabilität. Dank dieser Eigenschaften werden NL-Peptide, die wie natürliche Proteine ​​wirken, intakt aus dem Darm aufgenommen und während der Absorption nicht abgebaut.

BILDUNG VON NL-PEPTIDS™ DURCH SYNTHESE

Die chemische Darstellung von NL-Peptiden, die durch Modifizierung mittels Synthese erhalten werden, wird im Folgenden erörtert. Die Technologie, die auf dem Prinzip der Ausfällung des Peptids mit Arginin beruht, wurde durch eine Synthese mittels N-Acetylierung des Aminoterminus des Peptids mit gleichzeitiger Amidierung des Carboxylterminus weiter verbessert. Alle Modifizierungsprozesse wurden durchgeführt. führt zu einer zehnfachen Steigerung der Stabilität von NL-PEPTIDES und der bereits erwähnten Fähigkeit, natürliche Proteine ​​nachzuahmen.  

NL-PEPTIDE-VERABREICHUNGSTECHNOLOGIE™

Bei der Entwicklung einer modernen Technologie zur oralen Verabreichung von Peptiden war es wichtig, die Probleme zu lösen, die erstens mit der Schaffung einer einfachen, vielseitigen Technologie für eine breite Produktpalette sowie zweitens mit der gleichzeitigen Herstellung mehrerer wirksamer Produkte verbunden sind, dank einer Methode, die die Entwicklung eines Systems ermöglicht, das ein solches Vorgehen erlaubt. Frühere Absorptionsprobleme wurden allein durch die Anwendung der oben genannten Peptidmodifikationen gelöst. In unserem Fall konzentrierten wir uns neben der Peptidmodifizierung auf die zweifellos wichtige Lösung des Problems des Peptidtransports, von der Verabreichung in die Mundhöhle über den Durchgang durch den Dünndarm bis hin zur Absorption der Verbindung. Die Lösung für die genannten technologischen Probleme ist die Entwicklung einer neuen, einfachen und effektiven Peptid-Verabreichungstechnologie, die wir NL-PEPTIDES-DELIVERY™ nennen.

Betriebsprofil der NL-PEPTIDES DELIVERY™-Technologie

Das Wirkungsprofil basiert auf der NL-PEPTIDES DELIVERY-Technologie und ermöglicht es dem Peptid, den Dünndarm durch eine speziell entwickelte Hülle zu erreichen, die das NL-Peptid umgibt. Neben dem Erreichen des Dünndarms durch das Peptid ist es wichtig, dass das gesamte lokale Milieu im Darm die Absorption des dort zugeführten Peptids begünstigt. Dieses Problem ist aufgrund der im Darm vorhandenen Peptid-abbauenden Enzyme – Peptidasen – von Bedeutung. Die wichtigsten Peptid-abbauenden Enzyme sind proteolytische Enzyme, sogenannte Proteasen, die das Peptid durch Abbau im Dünndarm am Weitertransport hindern. Das Problem, das wir gelöst haben, ist die schlechte Absorption des Peptids selbst durch die Dünndarmwand.

VORTEILE DER NL-PEPTIDE-VERABREICHUNGSTECHNOLOGIE™

Mit Fokus auf das spezifische Wirkungsprofil der NL-PEPTIDES DELIVERY™-Technologie wird eine neue Doppelkapsel mit Schutzbeschichtung entwickelt, die sowohl das Problem des Erreichens des Peptids im Dünndarm als auch dessen Passage durch die Darmwand und den Abbau des Peptids an dieser Stelle löst. Die Schutzschicht, die die äußerste Oberfläche der Kapsel bildet, schützt den Wirkstoff vor pH-Wert-Schwankungen und Magensäure und ermöglicht so, dass das Peptid den Darm erreicht. Dank des in der Kapsel enthaltenen Proteaseinhibitors wird das abbaubare Peptid nicht zersetzt, während gleichzeitig der lokale pH-Wert im Darm gesenkt und die Darmumgebung für die Peptidaufnahme optimiert wird. Um die Aufnahme des Peptids durch den Dünndarm zu verbessern, wurde ein Absorptionsverstärker eingesetzt. Das NL-Peptid wurde verkapselt, wodurch es vom Proteaseinhibitor getrennt wurde. Der Inhibitor selbst ist eine Säure, die in Verbindung mit dem Peptid dieses zersetzen könnte. Durch die Trennung von der Säure mittels einer Kapsel-in-Kapsel-Konstruktion erhielten wir eine stabile pharmazeutische Zusammensetzung, die während der Lagerung nicht abgebaut wird.

FUNKTIONSWEISE DER NL-PEPTIDES DELIVERY™-TECHNOLOGIE IM VERDAUUNGSSYSTEM

Diese mit der NL-PEPTIDES-Technologie synthetisierten Peptide der neuen Generation sind in einer Doppelkapsel verkapselt, die mit dem NL-PEPTIDES DELIVERY™-System hergestellt wird. Nach oraler Einnahme durchläuft die Kapsel einen spezifischen Weg durch den Verdauungstrakt. Nach dem Schlucken erreicht die Kapsel intakt den Dünndarm, wo ein Proteaseinhibitor freigesetzt wird. Dieser senkt den pH-Wert im Darm auf 5,5 und schafft so ein optimales Absorptionsmilieu. Im nächsten Schritt werden der Wirkstoff und der Absorptionsverstärker freigesetzt, wodurch das Peptid effektiv vom Körper aufgenommen werden kann.

ERGEBNISSE DER ANWENDUNG DER NL-PEPTIDES DELIVERY™-TECHNOLOGIE

Die Konzentration des Peptids im Blut nach Einnahme unserer Doppelkapsel ist in der untenstehenden Grafik dargestellt. Das Ergebnis bestätigt eindeutig das Vorhandensein von NL-Peptid im Blut. Dies deutet auf die Aufnahme und den Transport des Peptids und somit auf seine Wirkung im Körper hin. Die ersten drei Beispielgrafiken zeigen Peptidpeaks aus ordnungsgemäß aufbereiteten Blutproben, analysiert über einen bestimmten Zeitraum. Dargestellt sind die Peaks von NL-GHK-CU, NL-EPITHALON und NL-BPC-157, die mit unserer patentierten NL-PEPTIDES-DELIVERY™-Technologie verabreicht wurden, sowie die Standardpeptide GHK-CU, EPITHALON und ARG-BPC, die in Standardkapseln verabreicht wurden. Die nächsten drei Diagramme zeigen die Verteilung der Peptidkonzentrationen im untersuchten Blut im Zeitbereich von 30-360 min, umgerechnet in pg/ml-Einheiten. Der Vergleich der Ergebnisse der oralen Verabreichung in Form einer Doppelkapsel mit der intranasalen Peptidverabreichung ermöglicht es uns, die Überlegenheit und Wirksamkeit einer der beiden Verabreichungsmethoden zu bestimmen. Wie die Grafik zeigt, ist die Peptidkonzentration bei oraler Verabreichung unserer Kapsel deutlich höher als bei intranasaler Verabreichung. In der Kapsel und im Nasenspray wurden die gleichen Peptiddosen verwendet. Die Ergebnisse dieser Studien unterstreichen die Vorteile unserer Technologie gegenüber der intranasalen Verabreichung.

Auswirkungen der Arbeit von Synthagen Laboratories

Unsere Aufgabe bestand darin, eine neue Technologie zu entwickeln, die die Wirksamkeit von Peptiden steigert. Die orale Peptidverabreichungstechnologie NL-PEPTIDES-DELIVERY basiert auf einer innovativen Peptidtherapie in Kombination mit einer von uns entwickelten neuartigen oralen Verabreichungsmethode. Die mehrkanalige Präsentation unserer Technologie in einem anschaulichen Präsentationsformat ermöglicht ein umfassendes Verständnis jedes einzelnen Schritts. Die Auswirkungen unserer Arbeit sind in der Präsentation zu sehen.