Peptide mit antimikrobiellen Eigenschaften und deren durch Modifizierung erzeugte Analoga.

Zusammenfassung: Die zunehmende Antibiotikaresistenz stellt eine der größten Herausforderungen der modernen Medizin dar. Unsachgemäßer und übermäßiger Gebrauch verfügbarer Medikamente hat deren Wirksamkeit aufgrund der wachsenden Zahl resistenter Mikroorganismen erheblich verringert. Aktuell wird an der Entwicklung wirksamerer Therapeutika geforscht, die auf natürlich vorkommenden Abwehrmechanismen (antimikrobiellen Peptiden) und deren möglichen Modifikationen basieren, um so Analoga zu gewinnen.

Schlüsselwörter : antimikrobielle Peptide; chemische Modifikationen; Zyklisierung; Wirkstoffkonjugate; Lipidierung

Abkürzungsverzeichnis : AMP – antimikrobielle Peptide

Das Konzept der Arzneimittelresistenz

Arzneimittelresistenz ist ein Konzept, das die Unfähigkeit von Krankheitserregern und Parasiten gegenüber Medikamenten beschreibt. Das bedeutet, dass diese Erreger in Gegenwart eines Medikaments, das sie eigentlich abtöten oder hemmen sollte, überleben und sich vermehren können, dies aber nicht tun. Man unterscheidet zwischen zwei Arten von Arzneimittelresistenz: angeborener und erworbener. Während angeborene Resistenz typischerweise bei Mikroorganismen auftritt, entsteht erworbene Resistenz durch die Einwirkung eines Medikaments und führt zu Veränderungen in deren DNA.

Peptide mit antimikrobiellen Eigenschaften – Charakteristika

Antimikrobielle Peptide (AMPs) sind eine Gruppe von Verbindungen, die aus 10 bis 50 Aminosäureresten bestehen. Ihre Nettoladung, die zwischen +2 und +9 liegt, resultiert aus dem Vorhandensein von L-Arginin-, L-Lysin- oder L-Histidinresten in der Peptidkette. Die AMP-Synthese kann auf zwei Wegen erfolgen. Zum einen durch ribosomale Translation von mRNA, die in allen Organismen stattfindet, zum anderen durch nichtribosomale Peptidsynthese, vorwiegend in Bakterien. Nichtribosomal synthetisierte Peptide, wie beispielsweise Polymyxin- und Gramicidin-S-basierte Antibiotika, werden aufgrund ihrer antimikrobiellen Wirkung häufig eingesetzt. Ribosomal synthetisierte Peptide finden jedoch zunehmend Anwendung, da sie die angeborene Immunität stimulieren. Antimikrobielle Peptide werden aus verschiedenen Organismen isoliert. (Abb. 1)

Abbildung 1. Organismen, aus denen antimikrobielle Peptide (AMPs) isoliert wurden

Defensine als tierische AMPs

Die meisten antimikrobiellen Peptide wurden aus Fischen, Amphibien und Säugetieren isoliert. Die größten Mengen wurden in Phagozyten, Neutrophilen, Makrophagen und Sekreten von Epithelzellen beobachtet. Defensine zählen aufgrund ihrer Fähigkeit, die Immunantwort des Wirts zu modulieren, zu den Verbindungen mit der stärksten bioziden Wirkung. Defensine sind amphipathische antimikrobielle Peptide, die reich an basischen Aminosäureresten und L-Cystein sind und in Tieren und Pflanzen vorkommen. Ihre biozide Wirkung richtet sich gegen ein breites Spektrum an grampositiven und gramnegativen Bakterien sowie Pilzen. Man unterscheidet drei Klassen von Defensinen: α-, β- und θ-Defensine, die sich in der Topologie ihrer Disulfidbrücken unterscheiden (Abb. 2).

Abbildung 2. Drei grundlegende Klassen von Defensinen, die in der Umwelt vorkommen

Die bekanntesten α-Defensine sind HNP1-4, die vorwiegend in der Plazenta, der Zervix und der Darmschleimhaut produziert werden; die Verbindungen HD5 und HD6, die in den Speicheldrüsen, der Darmwand, den Harnwegen und der Augenschleimhaut vorkommen; und NP5, das in Paneth-Zellen vorkommt. β-Defensine bilden die vielfältigste Klasse der antimikrobiellen Peptide (AMPs) und haben sich am längsten entwickelt. Sie wurden im genetischen Material aller bisher klassifizierten Wirbeltiere nachgewiesen. Zu den jüngst entdeckten Defensinen gehören die θ-Defensine, zu denen die Peptide RTD1-3 zählen. Defensine weisen ein breites Spektrum antimikrobieller Aktivität auf und sind aktiv an der Immunabwehr von Organismen beteiligt. So eliminiert beispielsweise das humane α-Defensin HD5 wirksam Infektionen mit Salmonella typhimurium und Staphylococcus aureus, während RTD-1 biozide Aktivität gegen Escherichia coli zeigt.

Pflanzliche AMP-Peptide

Antimikrobielle Peptide kommen in allen Pflanzenarten vor. Charakteristisch für pflanzliche AMPs ist das Vorhandensein von L-Cysteinresten und mehreren Disulfidbrücken, die zu einer kompakten Struktur beitragen und proteolytische sowie chemische Resistenz verleihen. Pflanzliche AMPs, zu denen insbesondere Thionine, Defensine und Cycloide zählen, bestehen aus 45 bis 47 Aminosäureresten pro Kette. Man unterscheidet zwei Untergruppen von Thioninen: 8c, die acht L-Cysteinreste in ihrer Sequenz enthalten und vier Disulfidbrücken bilden, und 6c, die sechs solcher Reste und drei -SS-Bindungen aufweisen.

Peptide mit antimikrobiellen Eigenschaften - Eigenschaften

Antimikrobielle Peptide werden zunehmend und erfolgreich als innovative Methode zur Behandlung von Antibiotikaresistenzen eingesetzt. Sie zeigen eine hohe Aktivität gegen gramnegative und grampositive Bakterien, Viren und Pilze. Darüber hinaus können Peptide mit antimikrobiellen Eigenschaften bakterielle Toxine neutralisieren, proinflammatorische Reaktionen und die Biofilmbildung hemmen sowie die Wundheilung beschleunigen.

Mechanismus des AMP-Eintritts in die Zelle

AMPs können über verschiedene Mechanismen in Bakterienzellen eindringen. In den meisten Fällen werden die Zellmembranen der Mikroorganismen während der Lyse zerstört. Dieser Prozess wird durch elektrostatische und hydrophobe Wechselwirkungen zwischen positiv geladenen Fragmenten von L-Arginin- oder L-Lysinresten und negativ geladenen Bereichen der Bakterienmembranen vermittelt. Es existieren drei Hauptmodelle für das Eindringen antimikrobieller Peptide durch die äußere Hülle der Mikroorganismen: das Dauben-, das Teppich- und das toroidale Modell (Abb. 3).

Abbildung 3. Schematische Darstellung der Mechanismen des Zellmembranzerfalls durch AMP: a) Fassdaubenmodell, b) Teppichmodell, c) Toroidmodell

a) Das Fassdaubenmodell basiert auf der Wechselwirkung amphipathischer α-helikaler Peptide mit der Bakterienmembran. Dabei bilden sich Transmembrankanäle oder Poren mit nach innen gerichteten hydrophilen Segmenten. Dies führt zum vertikalen Einbau von AMP in das Lipidskelett der Membran und stört das Membranpotenzial sowie den Ionengradienten. Infolgedessen wird die ATP-Synthese gehemmt und die Membranpermeabilität erhöht, was zu Zellschwellung und Osmose führt. b) Das Teppichmodell beschreibt die Bindung eines Peptids an die Membran und die Bildung eines „Teppichs“ auf ihrer Oberfläche. Die Peptidketten ordnen sich auf der Außenseite der Membran so an, dass ihre hydrophilen Bereiche den hydrophilen Phospholipidfragmenten und ihre hydrophoben Bereiche dem Membrankern zugewandt sind. Aufgrund elektrostatischer Wechselwirkungen binden positiv geladene Fragmente der AMP-Peptidkette an negativ geladene Phospholipide. Dies begrenzt die Membranpermeabilität durch die Peptidteppichstruktur, wodurch die Membran schließlich zerstört wird und mizellare Strukturen entstehen. c) Das toroidale Porenmodell basiert auf der Tatsache, dass AMPs an der Oberfläche der Lipiddoppelschicht aggregieren und diese dadurch nach innen wölben. Die hydrophilen Bereiche der Peptidkette binden an die polaren Köpfe der Membranlipide, was zum Zerfall der Membran und zur Bildung von Poren führt, die größer sind als jene im Fassdaubenmodell.

Beispiele für chemische Modifikationen von AMP

Trotz ihrer zahlreichen Vorteile weisen antimikrobielle Peptide auch viele Einschränkungen auf. Daher werden synthetische Analoga entwickelt, die die Schlüsselsequenz für die antimikrobielle Aktivität enthalten oder auf nativen AMPs basieren. Nachfolgend einige Beispiele:

1. Zyklisierung

Es sind vier Arten der Zyklisierung der Peptidkette natürlicher AMPs bekannt: zwischen dem N- und C-terminalen Fragment der Kette, zwischen dem N- oder C-Terminus der Peptidkette und einer funktionellen Gruppe in der Seitenkette einer der in der Sequenz vorhandenen Aminosäuren sowie innerhalb der Seitenketten selbst (Abb. 4). Diese Prozesse verbessern die Stabilität des Peptids, was zu einer höheren Resistenz gegenüber dem Abbau durch proteolytische Enzyme führt. Durch Cyclisierungsmodifikation erhaltene AMP-Analoga zeigten Eigenschaften wie: erhöhte antimikrobielle Aktivität gegen Escherichia coli- und Bacillus subtilis-Stämme, biozide Aktivität gegen grampositive Bakterien (verschiedene Stämme von Staphylococcus aureus und Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Corynebacterium bovis) und gramnegative Bakterien (Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Salmonella enteritidis, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae) sowie die Verwendung dieses AMP-Analogons bei Hautverbrennungen, postoperativer Wundversorgung und Infektionsprävention.

Abbildung 4. Ein Beispiel für eine AMP-Modifikation, nämlich die Zyklisierung.

2. Wirkstoffkonjugate

Eine weitere chemische Modifizierung von AMP ist die kovalente Bindung an Antibiotika. Dies verbessert deren antimikrobielle Aktivität und reduziert die therapeutische Dosis, wodurch Nebenwirkungen vermieden werden. Durch Modifizierung hergestellte AMP-Analoga, die als Wirkstoffkonjugate fungieren, weisen Eigenschaften wie eine erhöhte antimikrobielle Aktivität gegen Escherichia coli- und Bacillus subtilis-Stämme, biozide Aktivität gegen grampositive Bakterien, keine Toxizität gegenüber Epithelzellen und menschlichen Erythrozyten sowie biozide Aktivität gegen Staphylokokken-Stämme auf. Zudem werden die Analoga zur Behandlung von ambulant erworbener Pneumonie, akuter bakterieller Sinusitis und Pyelonephritis eingesetzt.

3. Lipidierung

Eine der wichtigsten posttranslationalen Modifikationen ist die Lipidierung, die neben der Regulation der Funktion von Peptiden und Proteinen auch deren Affinität zu Zellmembranen erhöht. Die Verwendung von synthetischen Analoga wird durch die Anzahl und Art der angehängten Fettsäuren sowie die Länge der Kohlenstoffketten bestimmt. Durch den Einbau von Lipidgruppen in Peptidketten lassen sich unter anderem die Wasserlöslichkeit neu synthetisierter Verbindungen, ihre Fähigkeit zur Selbstassemblierung und ihre thermische Stabilität verändern. Lipidierte AMP-Analoga zeigten Eigenschaften wie eine erhöhte antimikrobielle Aktivität gegen grampositive Bakterien (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis), gramnegative Bakterien (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa) und Pilze (Candida albicans, Candida tropicalis und Aspergillus brasiliensis).

Zusammenfassung

Eine der größten Herausforderungen der modernen Medizin ist der häufige Einsatz von Antibiotika, der zur Entwicklung neuer, resistenter Mikroorganismen führt. Ein möglicher Lösungsansatz für dieses wachsende Problem ist die Verwendung antimikrobieller Peptide (AMPs), die Bestandteile des körpereigenen Immunsystems sind. AMPs werden meist als positiv geladene Verbindungen mit amphiphiler Struktur definiert, die ihre antimikrobiellen Eigenschaften gegenüber einem breiten Spektrum von Bakterien, Viren und Pilzen moduliert. Die hohen Produktionskosten und die begrenzte Bioverfügbarkeit natürlicher AMPs haben die Suche nach neuen Modellsubstanzen notwendig gemacht, deren Wirkung auf bereits bekannten Mechanismen beruht.

Bibliographie

1. Veltri D, Kamath U, Shehu A, Deep learning improves antimicrobial peptide recognition. 2018; Bioinformatics 34: 2740–2747;

2. Manzini MC, Perez KR, Riske KA, Bozelli JC Jr, Santos TL, da Silva MA, Saraiva GK, Politi MJ, Valente AP, Almeida FC, Chaimovich H, Rodrigues. Peptid-Lipid-Verhältnis und Membranoberflächenladung bestimmen den Wirkungsmechanismus des antimikrobiellen Peptids BP100. 2014; Konformations- und Funktionsstudien. Biochim Biophys Acta 1838: 1985–1999.

3. Agrawal P, Raghava GPS, Vorhersage des antimikrobiellen Potenzials eines chemisch modifizierten Peptids anhand seiner Tertiärstruktur. 2018, Front Microbiol 9: 2551; doi: 10.3389/fmicb.2018.02551

4. Usmani SS, Bedi G, Samuel JS, Singh S, Kalra S, Kumar P, et al., THPdb: Datenbank für FDA-zugelassene Peptid- und Proteintherapeutika. 2017; doi: 10.1371/journal.pone.0181748

5. Xiao Y, Hughes AL, Ando J, Matsuda Y, Cheng JF, Skinner-Noble D, Zhang. Eine genomweite Untersuchung identifiziert einen einzelnen β-Defensin-Gencluster im Huhn: Implikationen für den Ursprung und die Evolution von Säugetierdefensinen. 2014; BMC Genomics 5: 56; doi: 10.1186/1471-2164-5-56