Peptidcharakterisierung. Peptidsynthese und -modifikationen.

Schlüsselwörter : Peptid; Peptidhydrolyse ; Peptidbindungen ; Peptidmodifikationen; Peptidsynthese ; Peptidbindung ; Peptidhormone; Peptidanaloga; Aussalzen; Amidierung; Acetylierung

Peptide

Peptide sind chemische Verbindungen, die – ähnlich wie Proteine ​​– aus Aminosäuren aufgebaut sind. Sie entstehen durch die Verknüpfung von zwei oder mehr Aminosäuren über eine Peptidbindung mittels Kondensation, wobei neben dem Peptid auch ein Wassermolekül gebildet wird (Abb. 1). Sie sind Gegenstand weitreichenden Interesses und erfüllen wichtige biologische Funktionen. Viele Hormone und Neurotransmitter sind Peptide. Endogene Peptide üben antimikrobielle Aktivität aus und fungieren als Teil des körpereigenen Abwehrsystems. Natürlich vorkommende Peptide und ihre synthetischen Analoga gelten aufgrund ihrer hohen Aktivität, geringen Toxizität und fehlenden Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten als attraktive Verbindungen mit therapeutischer Bedeutung. In der medizinischen Praxis werden aufgrund ihrer biologischen Instabilität und ihres schnellen Abbaus nur wenige Peptide eingesetzt. Die Peptidsynthese ermöglicht jedoch die Herstellung stabiler Formen. Ähnliches gilt für die Synthese von Peptiden aus natürlichen Quellen. Peptide kommen unverzweigt vor und besitzen nur zwei spezifische Enden. Eines davon ist das Aminoende, an dem eine Aminosäure mit einer freien α-Aminogruppe vorkommt. Das andere wird Carboxylterminus oder C-Terminus genannt, an dem eine Aminosäure mit einer freien α-Carboxylgruppe vorkommt.

Abbildung 1. Darstellung des Kondensationsprozesses, d. h. des Prozesses der Peptidbildung.

Peptidnomenklatur

Die Benennung von Peptiden beginnt mit dem Namen der N-terminalen Aminosäure, gefolgt von den Namen der nachfolgenden Aminosäuren und endet mit dem Namen der C-terminalen Aminosäure. Die Reihenfolge der Aminosäuren wird durch Drei- oder Einbuchstabensymbole angegeben.

Peptidbindung

Durch die Reaktion zwischen der α-Carboxylgruppe und dem Stickstoff der α-Aminogruppe entsteht eine Peptidbindung. Man geht davon aus, dass diese Bindung zwei Strukturen bildet, die in einem spezifischen Gleichgewicht stehen. Die C-N-Bindung wandelt sich in eine C=N-Bindung um und umgekehrt. Eine Drehung um die C=N-Achse ist unmöglich, wodurch die Peptidbindung so starr ist, dass sie die Eigenschaften einer Doppelbindung aufweist. Bei einer Peptidbindung zwischen der Iminogruppe von Prolin oder Hydroxyprolin und der Carboxylgruppe einer anderen Aminosäure entsteht eine andere, eigenständige Struktur. In diesem Fall ist der Stickstoff in die Pyrrolidinringstruktur eingebaut; es fehlt ein Wasserstoffsubstituent, wodurch eine Drehung um die in Gegenwart von Stickstoff gebildeten Bindungen verhindert wird. Aminosäuren, die an der Bildung einer Peptidbindung beteiligt sind, verlieren Molekülfragmente. Dies sind -OH-Moleküle der Carboxylgruppe und -H-Moleküle der Aminogruppe. Daher werden die in Peptiden und Proteinen vorkommenden Aminosäuren als Aminosäurereste bezeichnet. Die entstehenden Peptidbindungen sind stabil und können nur durch Einwirkung starker Basen und Säuren bei hohen Temperaturen gespalten werden. Der Prozess der Peptidbindungsbildung ist in Abbildung 2 dargestellt.

Abbildung 2. Schema der Peptidbindungsbildung

Peptidbindungsbruch

Die Spaltung einer Peptidbindung erfolgt durch Peptidhydrolyse, eine Reaktion, bei der die gebildeten Peptidbindungen gespalten und einzelne Aminosäuren regeneriert werden. An dieser Reaktion ist Wasser beteiligt, das in Hydroxylgruppen (-OH) und Wasserstoffatome (H) dissoziiert und sich anschließend mit den freigesetzten Bindungen verbindet. Die Peptidhydrolyse ist in Abbildung 3 dargestellt.

Abbildung 3. Der Hydrolyseprozess, der zur Spaltung der Peptidbindung führt.

Peptidklassifizierung

Peptide werden nach der Anzahl der Aminosäuren, aus denen sie bestehen, klassifiziert. Die allgemeine Klassifizierung von Peptiden umfasst:

• Dipeptide – Produkte, die aus der Reaktion zweier Aminosäuren entstehen, wobei die freie Aminogruppe der einen Aminosäure und die freie Carboxylgruppe der zweiten Aminosäure erhalten bleiben;

• Oligopeptide – Peptide, die aus einigen bis etwa einem Dutzend Aminosäuren bestehen;

• Polypeptide – längere Peptide, die mehrere Dutzend Aminosäurereste enthalten;

• Proteine ​​– Bezeichnung, wenn das Molekül aus mehr als einhundert Aminosäureresten besteht.

Peptidformeln

Peptidformeln werden auf der Grundlage einer Tabelle erstellt, die die Formeln der Proteinaminosäuren und ihre Abkürzungen enthält (Tabelle 1).

Tabelle 1. Aminosäureformeln, die für die Benennung von Peptiden verwendet werden

Peptidaktivitätsspektrum

Peptide weisen ein breites Spektrum an biologischer Aktivität auf und werden zur Behandlung von bakteriellen Infektionen, Viruserkrankungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Erkrankungen des Skelettsystems, Erkrankungen des Nervensystems, Diabetes und Osteoporose eingesetzt.

Vorteile von Peptiden

• Hohe Aktivität und Selektivität
• Breites Spektrum molekularer Zielstrukturen
• Potenziell geringere Toxizität im Vergleich zu niedermolekularen Verbindungen
• Geringe Gewebeansammlung
• Hohe chemische und biologische Vielfalt
• Auf Genebene nachweisbar
• Einfache Synthese von Analoga

Peptidsynthese

Je nach gewünschtem Peptid benötigen wir eine geeignete Synthesemethode. In dieser kurzen Erklärung wird die Peptidsynthese in Bezug auf ihre Größe dargestellt. Zur Synthese eines Dipeptids muss ein Reagenz verwendet werden, das die Carboxylgruppe der arylierenden Aminosäure aktiviert oder die acylierende Aminosäure in ein Anhydrid umwandelt. Die Synthese größerer Peptide, ausgehend von einem Dipeptid, ist arbeitsintensiv und aufwendiger. Hierbei wird die Aminoschutzgruppe der N-terminalen Aminosäure abgespalten und diese mit der nächsten N-geschützten Aminosäure acyliert. Dieser Prozess ist besonders zeitaufwendig, da diese Schritte so lange wiederholt werden müssen, bis ein Peptid mit der gewünschten Sequenz erhalten ist. Für die Herstellung großer Peptide ist die Merifield-Methode die effektivste und einfachste. Diese Methode wird in der Festphase durchgeführt. Die C-terminale Aminosäure wird an das Polymer gebunden, und anschließend wird die nächste Aminosäure hinzugefügt, bis die gewünschte Kettenlänge erreicht ist.

Biologisch aktive Peptide

Peptidhormone und Proteinhormone sind allgegenwärtig. Früher waren sie hauptsächlich instabilen Formen bekannt. Dank der Synthese ist es zunehmend möglich, je nach Bedarf des Körpers eine lang anhaltende und wirksame Peptidtherapie auszuwählen. Daher ist es ratsam, die Hormonstimulation mit Bedacht und Sicherheit zu behandeln. Betrachtet man einige biologisch aktive Peptide, so kann man Glutathion als Beispiel nehmen. Glutathion ist ein Tripeptid mit einer spezifischen Struktur, bestehend aus Glutamat, Cystein und Glycin, wobei Glycin als N-terminale Aminosäure vorliegt. Die Kombination von Glutamat und Cystein ist jedoch für Peptide und Proteine ​​ungewöhnlich, da Glutamat keine α-Carboxylgruppe, sondern eine γ-Carboxylgruppe besitzt. Glutathion kommt daher in reduzierter und oxidierter Form vor, als γ-Glutamylcysteinylglycin. In seiner reduzierten Form besitzt es eine freie Sulfhydrylgruppe, während in seiner oxidierten Form zwei Wasserstoffatome von den –SH-Gruppen abgespalten sind. Die Schwefelatome bleiben wasserstofffrei, wodurch eine Disulfidbrücke entsteht. Die Fähigkeit von Glutathion, zwischen oxidiertem und reduziertem Zustand zu wechseln, ist für Redoxprozesse von Bedeutung.

Ein weiteres Beispiel sind Oxytocin und Vasopressin, Nanopeptide, die von hypothalamischen Neuronen produziert und vom Hypophysenhinterlappen freigesetzt werden. Sie unterscheiden sich lediglich in zwei Aminosäuren. Cystein kommt an zwei Positionen vor, was zur Bildung einer Disulfidbrücke führt. Oxytocin wirkt als Hormon, das die Wehen auslöst. Vasopressin hingegen stimuliert die Wasserresorption in den Nierentubuli. Zudem spielt Vasopressin eine wichtige Rolle bei der Regulation der ACTH-Ausschüttung in Stresssituationen.

Peptidhormone

Adrenocorticotropes Hormon (ACTH)

Das adrenocorticotrope Hormon (ACTH), ein Peptid aus 39 Aminosäuren, entsteht durch den Abbau des deutlich größeren Vorläufermoleküls Proopiomelanocortin (POMC). POMC dient auch als Quelle weiterer aktiver Peptide. ACTH enthält zwei Peptide: das α-melanotrope Hormon (α-MSH), das strukturell mit den ersten 13 Aminosäuren von ACTH identisch ist, und ein Peptid des intermediären Hypophysensegments, das dem Corticotropin ähnelt – das Fragment 18–39 von ACTH. Die Hauptfunktion von ACTH besteht vermutlich in der Stimulation der Nebennierenrinde zur Sekretion von Steroidhormonen. ACTH reguliert die Aktivität der Zona fasciculata und der Zona reticularis. Die ersten 18 Aminosäuren sind für die biologische Aktivität von ACTH verantwortlich. ACTH wird durch das Corticotropin-Releasing-Hormon (CRH) reguliert, ein Hormon des Hypothalamus, das über Cortisol mittels eines negativen Feedback-Mechanismus Corticotropin freisetzt. Das bedeutet, dass ein Cortisolmangel die Ausschüttung von CRH und ACTH stimuliert, während ein Cortisolüberschuss deren Sekretion hemmt. Die Cortisol-Freisetzung reguliert somit zahlreiche wichtige Körperfunktionen, darunter die Reaktion des Körpers auf Stress, den Blutdruckanstieg und die entzündungshemmende Wirkung. ACTH wird in einem pulsierenden zirkadianen Rhythmus ausgeschüttet, d. h. seine höchste Konzentration findet sich morgens, wenn es am dringendsten benötigt wird, und nimmt im Laufe des Tages ab. Eine erhöhte ACTH-Sekretion tritt bei Erkrankungen wie Nebennierenrindeninsuffizienz, Cushing-Syndrom oder Nelson-Syndrom auf.

Insulin und C-Peptid

Insulin und C-Peptid werden kontinuierlich von der menschlichen Bauchspeicheldrüse ausgeschüttet. Während der Insulinproduktion entsteht C-Peptid im Rahmen der Insulinbiosynthese. Die Zellen der Bauchspeicheldrüse produzieren zunächst Proinsulin, das durch die Abspaltung von Aminosäuren weiter modifiziert wird. Dadurch entsteht Proinsulin, das aus zwei Ketten, A und B, besteht, die durch C-Peptid verbunden sind. Anschließend spaltet sich das C-Peptid vom Proinsulin ab, wodurch die endgültige Form des Insulins entsteht. Sobald Glukose in den Körper gelangt, erhält die Bauchspeicheldrüse ein Signal zur Freisetzung der Granula, die die gespeicherten Insulin- und C-Peptid-Moleküle enthalten. C-Peptid verbleibt deutlich länger in der Leber als Insulin, da es dort nicht abgebaut wird. Der Abbau erfolgt hauptsächlich in den Nieren. Sowohl bei Insulin als auch bei C-Peptid führen erhöhte oder extrem niedrige Konzentrationen zur Entwicklung von Typ-1- oder Typ-2-Diabetes und des Cushing-Syndroms. Im Falle des C-Peptids können Konzentrationsschwankungen auch auf chronisches Nierenversagen, das Vorliegen von Metastasen oder ein lokales Tumorrezidiv hinweisen. Deshalb ist es so wichtig, normale Konzentrationswerte aufrechtzuerhalten.

Schmetterling

Motilin ist ein Hormon, das mit der glatten Muskulatur von Magen und Darm assoziiert ist und von Vagusnervenfasern gesteuert wird. Es wird in endokrinen Zellen synthetisiert und von Zellen des Dünndarms produziert. Als Bestandteil der endokrinen Zellen des Verdauungssystems (Mo) ist es an der Regulation der gastrointestinalen Motilität beteiligt. Motilin spielt eine entscheidende Rolle bei der Bildung der Phase III des migratorischen Motorkomplexes (MMC). In dieser Phase entleeren Magen und Dünndarm den Magen von überschüssigem Nahrungsbrei und abgestoßenen Epithelzellen durch Anregung peristaltischer Bewegungen. Das Hormon beeinflusst zudem die Gallenblasenentleerung während der interdigestiven Phase, wenn die Motilinkonzentrationen am höchsten sind.

Glucagon

Glucagon ist eines der Hormone, die den Blutzuckerspiegel regulieren. Dieses Peptid wird von den endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse ausgeschüttet. Es handelt sich um ein Polypeptid aus 29 Aminosäuren, das aus einer Vorstufe mit 180 Aminosäuren entsteht. Veränderungen der Glukosekonzentration ermöglichen die Glucagonausschüttung. Glucagon wird in den Langerhans-Inseln der Bauchspeicheldrüse produziert, wo Proglucagon in Glucagon und Glycin-abhängiges pankreatisches Polypeptid (GRPP) umgewandelt wird. Die Hauptaufgabe von Glucagon besteht darin, den Blutzuckerspiegel bei Blutzuckerabfällen zwischen den Mahlzeiten oder während körperlicher Anstrengung aufrechtzuerhalten. In solchen Situationen werden Glucagonspeicher in der Leber freigesetzt, um den Körper ausreichend zu schützen. Zusätzlich kann Glucagon an der Regulierung der Nahrungsaufnahme beteiligt sein, was zu einem früheren Sättigungsgefühl führen kann. Glucagon kann möglicherweise die Freisetzung von Ghrelin hemmen und dadurch die Darmperistaltik unterdrücken.

Peptidanaloga

Peptidanaloga sind chemische Verbindungen, bei denen ein Atom der ursprünglichen Verbindung durch ein anderes ersetzt wird. Die Gesamtstruktur des Peptids bleibt dabei unverändert. Zu den Peptidanaloga zählen Helix-, β-Faltblatt- und β-Schleifen-Analoga. Bei den Helixanaloga ist die Helixstruktur ein Schlüsselelement bioaktiver Peptide. Die Stabilisierung kurzer Oligomerfragmente in einer Helixkonformation erhöht die Aktivität. Bei β-Faltblatt- und β-Schleifen-Analoga werden D-Aminosäure- bzw. β,γ,δ-Aminosäurereste eingefügt. Peptidanaloga ermöglichen die Gewinnung neuer, stabilerer Peptidverbindungen mit einem breiteren Anwendungsspektrum und bieten innovative Lösungsansätze für Probleme im Zusammenhang mit der Aktivität bestehender Präanaloga.

Peptidausfällung

Beim Aussalzen werden die Ladungen der Proteine ​​verändert. Die Anionen und Kationen des Salzes neutralisieren die Ladungen. Die Proteinmoleküle ziehen sich nicht mehr gegenseitig an und bilden keine Aggregate. Durch den Verlust der Wasserhülle fällt das Protein aus. Das Aussalzen ist reversibel. Im umgekehrten Prozess wird das Salz durch Dialyse entfernt oder seine Konzentration durch Zugabe von Wasser reduziert. Aus unseren vorherigen Artikeln lässt sich festhalten, dass das Aussalzen, das zur Bildung einer stabilen Form des BPC-157-Peptids führte, eine innovative Methode zur Sicherstellung der Peptidstabilität und damit zur Erweiterung der biologischen Aktivität von Peptiden darstellt.

Peptidacetylierung

Bei der Acetylierung werden durch das Enzym N-Acetyltransferase Acetylradikale an Substrate mit NH₂-, OH- oder SH-Gruppen angefügt. Acetyl-CoA dient als Quelle für die Acetylradikale. Die Hauptfunktion der N-Acetyltransferasen besteht in der Anlagerung der Acetylgruppe an die Aminogruppe aromatischer Amine und Hydrazine (N-Acetylierungsreaktion), d. h. in der Entgiftung potenziell toxischer exogener Verbindungen.

Peptidamidierung

Bei der Spaltung von Peptidbindungen und der damit einhergehenden Fragmentierung der Polypeptidkette entstehen Carbonylgruppen. Die Oxidation eines Proteinmoleküls durch ein Hydroxylradikal beginnt mit der Abspaltung eines Wasserstoffatoms vom α-Kohlenstoffatom der Aminosäure. Das entstehende Alkylradikal reagiert mit Sauerstoff zu einem Alkylperoxidradikal, welches sich anschließend in ein Alkylhydroperoxid umwandelt. Das resultierende Alkoxyradikal kann entweder in einen am α-Kohlenstoffatom hydroxylierten Aminosäurerest übergehen oder zur Fragmentierung der Polypeptidkette führen. Die Anwesenheit eines Alkoxyradikals fördert die Fragmentierung der Polypeptidkette. Die Spaltung von Peptidbindungen kann über α-Amidierung oder Diamidierung erfolgen. Das bei der α-Amid-Fragmentierung entstehende N-terminale Peptid besitzt eine Amidgruppe am C-Terminus, während das zweite Peptid ein N-α-Ketoacylderivat am N-Terminus aufweist. Die Fragmentierung über den Diamidweg ist durch die Bildung eines N-terminalen Peptids mit einer Diamidstruktur und eines vom C-Terminus des Proteinmoleküls abgeleiteten Peptids mit einer Isocyanatstruktur am N-Terminus gekennzeichnet.

Bibliographie 1. Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell V, Harper's Biochemistry. 1995; PZWL Medical Publishing House 2. Jakubke HD, Jeschkeit H, Aminosäuren, Peptide, Proteine. 1982; Staatlicher Wissenschaftlicher Verlag 4. Kołodziejczak A, Aminosäuren und Peptide. 2006