Słowa kluczowe: peptyd; modyfikacje peptydowe, synteza peptydu; wiązanie peptydowe; hydroliza; hormony peptydowe; analogi peptydowe; wysolenie; amidacja; acetylacja
Peptydy
Peptydy są związkami chemicznymi zbudowanymi podobnie jak białka, z aminokwasów. Powstają przez połączenie dwóch lub więcej aminokwasów za pomocą wiązania peptydowego w wyniku procesu kondensacji, gdzie oprócz peptydu, powstaje również cząsteczka wody. (Rys.1) Są przedmiotem szerokiego zainteresowania, pełniąc ważne funkcje biologiczne. Wiele hormonów jak i neurotransmiterów jest właśnie peptydami. W przypadku endogennych peptydów działają one przeciwdrobnoustrojowo, działając jako system obronny organizmu. Naturalnie występujące peptydy oraz ich syntetyczne analogi uznawane za atrakcyjne związki o znaczeniu terapeutycznym ze względu na wysoki stopień aktywności, niską toksyczność oraz brak interakcji z lekami. W praktyce medycznej tylko kilka peptydów znajduje zastosowanie ze względu na biologiczną nietrwałość i szybki rozpad, jednak synteza peptydów pozwala na uzyskanie form stabilnych. Podobnie jest np. w przypadku syntezy peptydów z naturalnych źródeł. Peptydy występują w formie nierozgałęzionej, posiadają jedynie dwa specyficzne końce. Jeden z nich nosi nazwę końca aminowego, gdzie występuje aminokwas z wolną grupą α-aminową. Drugi nazywany jest końcem karboksylowym lub końcem C gdzie występuje aminokwas w wolną grupą α-karboksylową.
Rysunek 1. Przedstawienie procesu kondensacji czyli procesu powstawania peptydu
Nazewnictwo peptydów
Nazewnictwo peptydów rozpoczyna się poprzez nazwę reszty aminokwasu N-końcowego, następnie wymienia się nazwy kolejnych reszt aminokwasowych a kończy się nazwą aminokwasu C-końcowego. Za pomocą symboli trójliterowych lub jednoliterowych zapisuje się kolejność aminokwasów.
Wiązanie peptydowe
Węgiel w wyniku reakcji grupy α-karboksylowej wiąże się z azotem grupy α-aminowej za pomocą pojedynczego wiązania, wiązania peptydowego. Przypuszczalnie uznaje się, że wiązanie to powstaje w postaci dwóch struktur, które pozostają w określonej, wzajemnej równowadze. Wiązanie C-N przechodzi w C=N oraz na odwrót. Rotacja względem osi C=N nie jest możliwa, poprzez co wiązanie peptydowe jest na tyle sztywne, iż posiada cechy wiązania podwójnego. W przypadku wiązania peptydowego przy udziale grupy iminowej proliny czy hydroksyproliny z grupą karboksylową innego aminokwasu powstaje inna, odrębna struktura. Azot w tym przypadku jest wbudowany w strukturę pierścienia pirolidynowego, nie występuje podstawnik wodorowy poprzez co nie ma możliwości rotacji względem wiązań, które powstają w obecności azotu. Aminokwasy, które biorą udział przy tworzeniu się wiązania peptydowego tracą fragmenty cząsteczek. Są to cząsteczki -OH z grupy karboksylowej i -H z grupy aminowej. Dlatego też aminokwasy, które znajdują się peptydach i białkach nazywamy resztami aminokwasowymi. Powstałe wiązania peptydowe są trwałe a ich rozpad może nastąpić dopiero przy działaniu mocnych zasad i kwasów przy równocześnie wysokiej temperaturze. Sposób powstawania wiązania peptydowego przedstawiony został na schemacie. (Rys.2)
Rysunek 2. Schemat powstawania wiązania peptydowego
Zerwanie wiązania peptydowego
Zerwanie wiązania peptydowego zachodzi w wyniku reakcji hydrolizy, która opiera się na rozerwaniu utworzonych wiązań peptydowych i odtworzeniu poszczególnych aminokwasów. W reakcji tej bierze udział woda, której cząsteczki rozpadają się na grupy wodorotlenowe (-OH) i atomy wodoru (H), a następnie łączą się z uwolnionymi wiązaniami substancji. Schemat reakcji hydrolizy przedstawiony jest na schemacie. (Rys.3)
Rysunek 3. Proces hydrolizy powodującej zerwania wiązania peptydowego
Klasyfikacja peptydów
Klasyfikacje peptydów ustala się ze względu na ilość aminokwasów, z których są zbudowane. W ogólnej klasyfikacji peptydów wyróżniamy:
-
Dipepetydy- produkty, jakie powstają z reakcji dwóch aminokwasów przy zachowaniu wolnej grupy aminowej jednego z aminokwasów i wolną grupę karboksylową drugiego aminokwasu;
-
Oligopeptydy- peptydy, które złożone są od kilku do kilkunastu aminokwasów;
-
Polipeptydy- dłuższe peptydy, zawierające po kilkadziesiąt reszt aminokwasowych;
-
Białka – przyjęto, gdy cząsteczka składa się z powyżej stu reszt aminokwasowych.
Wzory peptydów
Wzory peptydów tworzy się na podstawie tabeli, w której zawarte są wzory aminokwasów białkowych oraz ich skróty (Tab.1)
Tabela 1. Wzory aminokwasów służące do nazewnictwa peptydów
Spektrum aktywności peptydów
Peptydy wykazują szerokie spektrum aktywności biologicznej i są stosowane w leczeniu infekcji bakteryjnych, chorób wirusowych, chorób układu krążenia, układu kostnego, układu nerwowego, cukrzycy czy osteoporozy.
Zalety peptydów
- Wysoka aktywność i selektywność
- Szeroki zakres celów molekularnych
- Potencjalnie mniejsza toksyczność w porównaniu do związków niskocząsteczkowych
- Niska akumulacja w tkankach
- Wysokie zróŜnicowanie chemiczne i biologiczne
- Możliwe do odkrycie na poziomie genów
- Łatwa synteza analogów
Synteza peptydów
W zależności od peptydu jaki chcemy otrzymać, potrzebujemy odpowiedniej metody jego syntezy. W krótkim wyjaśnieniu postaramy się przedstawić syntezę peptydów w odniesieniu od jego wielkości. Do otrzymania dipeptydu należy zastosować odczynnik, który doprowadzi do aktywacji grupy karboksylowej aminokwasu arylującego lub przeprowadzić aminokwas acylujący w bezwodnik. Pracochłonnym i trudniejszym procesem jest synteza w przypadku większych peptydów, które otrzymujemy z dipeptydu, gdzie dochodzi do usunięcia osłony grupy aminowej aminokwasu N-terminalnego i acylowania go kolejnym N-chronionym aminokwasem. Proces ten jest szczególnie czasochłonny, ponieważ wspomniane czynności powtarza się aż do momentu uzyskania peptydu o zaplanowanej sekwencji. W przypadku otrzymywania dużych peptydów najlepiej sprawdzającą się i najłatwiejszą metodą jest metoda Merifielda. Metodę tą przeprowadza się na etapie fazy stałej. C-końcowy aminokwas przytwierdza się do polimeru a następnie przyłącza się kolejnego aminokwasu, aż do momentu, w którym osiągnięta zostanie pożądana długość łańcucha.
Peptydy biologicznie aktywne
Hormony peptydowe oraz hormony białkowe powszechnie występują w otaczającym nas środowisku. Wcześniej znane w większości jako mało stabilne formy. Pod wpływem syntezy można coraz śmielej dobrać terapię peptydową, która będzie trwała i skuteczna w zależności od potrzeb organizmu. Dlatego właśnie warto umiejętnie i bezpiecznie bawić się ze stymulacją hormonów. Biorąc pod uwagę, niektóre peptydy, będące biologicznie aktywne możemy za przykład podać glutation, który będąc tripeptydem o specyficznej strukturze zbudowany jest z glutaminianu, cysteiny i glicyny. Glutaminian występuje jako aminokwas N-końcowy. Połączenie glutaminianu z cysteiną jest jednak nietypowe dla peptydów i białek, ponieważ nie występuje tutaj grupa α-karboksylowa glutaminianu tylko grupa γ-karboksylowa. Glutation, zatem występuje w formie zredukowanej i utlenionej, będąc γ-glutamylocysteinyloglicyną. W formie zredukowanej posiada wolną grupę sulfhydrylową a w formie utlenionej następuje odłączenie się pary atomów wodoru od grup –SH. Atomy siarki pozostają pozbawione wodoru czego następstwem jest utworzenie mostku disiarczkowego. Zdolności modyfikacyjne glutationu w stan utleniony czy zredukowany jest istotny przy procesach oksydacyjno-redukcyjnych.
Przykładem jest również oksytocyna i wazopresyna, które będąc nanopeptydami, które są wytwarzane przez neurony podwzgórza, uwalniane przez tylny płat przysadki mózgowej, różnią się tylko dwoma aminokwasami. Cysteina występuje w dwóch pozycjach prowadząc w ten sposób do powstania mostku disiarczkowego. Oksytocyna występuje jako hormon pobudzający czynność skurczowe macicy. Wazopresyna pobudza natomiast wchłanianie wody w kanalikach nerkowych. Wazopresyna odgrywa również istotną rolę w regulacji wydzielania hormonu adrenokortykotropowego (ACTH) przy sytuacjach stresowych.
Hormony peptydowe
Hormon adrenokortykotropowy (ACTH)
Hormon adrenokortykotropowy jako 39-aminokwasowy peptyd, powstaje na skutek degradacji o wiele większej cząsteczki prekursorów jaką jest proopiomelanokortyny (POMC). Proopiomelanokortyna występuje jako źrodło również innych aktywnych peptydów. Dwa peptydy zawarte są właśnie w strukturze ACTH. Należą do nich hormon α-melanotropowy (α-MSH), będący w strukturze identyczny z pierwszymi 13 aminokwasami ACTH i peptyd pośredniej części przysadki podobny do kortykotropiny-fragment 18-39 ACTH. Jako podstawową funkcję ACTH uważa się pobudzenie kory nadnerczy w taki sposób aby była ona zdolna do wydzielania hormonów steroidowych. Hormon adrenokortykotropowy jest odpowiedzialny za regulację czynności na poziomie warstwy pasmowatej i siatkowatej. Za aktywność biologiczną ACTH odpowiedzialnych jest pierwszych 18 aminokwasów. Regulacja ACTH odbywa się poprzez kortykoliberynę (CRH) będącej hormonem występującym w podwzgórzu, uwalniający kortykotropinę przez kortyzol za pomocą ujemnego sprzężenia zwrotnego. Oznacza to, że niedobór kortyzolu powoduje pobudzenie CRH i ACTH a jego nadmiar wydzielanie to hamuje. Tym samym uwalniając kortyzol dochodzi do regulacji wielu istotnych funkcji życiowych m.in. mobilizacja organizmu do warunków stresowych, podwyższenie ciśnienia krwi czy zdolności przeciwzapalne. Wydzielany pulsacyjnie w rytmie dobowym ACTH oznacza, iż najwyższe jego stężenie obserwuje się w godzinach porannych kiedy jest to najbardziej pożądane, następnie, wraz z upływem dnia spada. Wzrost wydzielania ACTH obserwuje się w takich przypadkach chorobowych jak niedoczynność kory nadnerczy, choroba Cushinga czy zespół Nelsona.
Insulina i peptyd C
Insulina i peptyd C są wydzielane w trzustce przez organizm człowieka cały czas. Podczas produkcji insuliny, w procesie jej biosyntezy, produkowany jest peptyd C. Komórki trzustkowe produkują w pierwszym etapie peproinsulinę poddawaną dalszej modyfikacji poprzez odłączenie aminokwasów co prowadzi do powstania proinsuliny złożonej z dwóch łańcuchów A i B, które połączone są peptydem C, następnie dochodzi do odłączenia proinsuliny peptydu C co powoduje powstanie ostatecznej formy. W momencie pojawienia się w organizmie glukozy, trzustka otrzymuje sygnał do uwolnienia ziarnistości ze zmagazynowaną cząsteczką insuliny i peptydu C. Peptyd C utrzymywany jest w wątrobie znacznie dłużej niż insulina, ze względu na to, że nie zostaje on w niej zdegradowany. Jego rozkład zachodzi głównie w nerkach. W przypadku insuliny jak i peptydu C, podwyższone lub zbyt niskie stężenie prowadzi do rozwinięcia cukrzycy typu I lub II a także chorobie Cushinga. W przypadku peptydu C wahania stężenia mogą wskazywać również na przewlekłą niewydolności nerek czy obecności przerzutów lub miejscowej wznowy guza, dlatego tak ważne jest utrzymanie prawidłowych norm ich stężenia.
Motylina
Motylina jest hormonem związanym z mięśniami gładkimi żołądka i jelit, kontrolowana przez włókna nerwu błędnego. Syntetyzowana w komórkach endokrynnych. Jako hormon peptydowy, który zbudowany jest z 22 aminokwasów zlokalizowanych w konkretnej sekwencji, produkowana jest przez komórki jelita cienkiego. Wytwarzana przez komórki endokrynne układu pokarmowego M (Mo), bierze udział w regulacji motoryki przewodu pokarmowego. Motylina jest istotnym hormonem uczestniczącym w powstaniu III fazy wędrującego kompleksu motorycznego (MMC), w której żołądek i jelito cienkie mają za zadanie opróżnić żołądek ze zbędnych resztek pokarmowych i złuszczonych komórek nabłonkowych, poprzez pobudzenie ruchów perystaltycznych. Hormon dodatkowo wpływa na opróżnianie pęcherzyka żółciowego podczas okresu między trawiennego przy najwyższym stężeniu motyliny.
Glukagon
Glukagon jest jednym z hormonów zaangażowanych w regulację stężenia glukozy, peptyd ten jest wydzielany przez komórki endokrynne trzustki. Jest on polipeptydem złożonym z 29 aminokwasów, powstałym z prekursora o budowie 180 aminokwasów. Zmiany stężenia glukozy pozwalają na wydzielanie glukagonu. Produkcja hormonu jakim jest glukagon zachodzi w wyspach trzustkowych, w których z proglukagonu powstaje glukagon jak i glicentyno-zależny polipeptyd trzustkowy (GRPP). Głównym zadaniem glukagonu jest utrzymanie prawidłowego stężenia glukozy, w surowicy, podczas jej spadku między posiłkami czy przy wysiłku fizycznym. Jego zapasy w takich sytuacjach zostają uwolnione z wątroby aby zapewnić organizmowi odpowiednią ochronę. Dodatkowo może uczestniczyć w regulacji podczas pobierania pokarmu, przez co uczucie sytości może pojawić się wcześniej. Glukagon potencjalnie może hamować uwalnianie greliny w także hamować perystaltykę jelit.
Analogi peptydów
Analogami peptydów nazywamy odpowiednie związki chemiczne, dzięki którym jeden atom jest zastąpiony innym w stosunku do związku wyjściowego. Ogólna budowa peptydu pozostaje niezmieniona. Do analogów peptydowych należą analogi o strukturze helisy oraz analogi β-zgięć i β-kartek. W pierwszym z nich helisy są jednym z kluczowych elementów strukturalnych bioaktywnych peptydów. Stabilizowanie krótkich fragmentów oligomerów w konformacji helikalnej powoduje zwiększenie aktywności. W analogach β-zgięć i β-kartek dochodzi do wstawienie reszt D-aminokwasowych lub β,γ,δ-aminokwasowych. Analogi peptydowe pozwalają nam na otrzymanie nowych związków peptydowych, które będą stabilniejsze, znajdą zastosowanie w szerszym spektrum objawowym jak i pozwolą na innowacyjne rozwiązywanie problemów, związanych z działaniem dotychczasowych form przed analogowych.
Wysolenie peptydów
Proces wysalania polega na zmianie ładunków białkowych. Ładunki białka zostają zobojętnione przez aniony i kationy soli. Cząsteczki białka nie przyciągają się i nie tworzą agregatów a samo białko zostaje wytrącone na skutek utraty płaszcza wodnego. Proces wysalania jest procesem odwracalnym. W procesie odwrotu dochodzi do usunięcia soli przez dializę lub obniżenie jej stężenia przez dodanie wody. W oparciu o nasze wcześniejsze artykuły można śmiało stwierdzić, iż wysolenie, które doprowadziło do powstania stabilnej formy peptydu BPC-157 jest innowacyjną metodą w zapewnianiu stabilności peptydowej a co za tym idzie rozszerzenia działania biologicznego peptydów.
Acetylacja peptydów
Acetylacja polega na przyłączeniu rodników acetylowych do substratów, którymi są związki z grupą NH2, OH lub SH przy udziale enzymu N-acetylotransferazy. Źródłem rodnika acetylowego jest acetylo-CoA. Główną funkcją N-acetylotransferaz jest ułatwianie połączenia grupy acetylowej z grupą aminową amin aromatycznych i hydrazyn (reakcja N-acetylacji), czyli detoksykacja potencjalnie toksycznych związków egzogennych.
Amidacja peptydów
W momencie, gdy dochodzi do rozerwania wiązań peptydowych i w konsekwencji do fragmentacji łańcucha polipeptydowego, dochodzi do powstania grup karbonylowych. Utlenianie cząsteczki białka przez rodnik hydroksylowy rozpoczyna się od oderwania atomu wodoru przy węglu α aminokwasu. Powstający rodnik alkilowy reaguje z tlenem tworząc rodnik alkilonadtlenkowy przechodzący w alkilowodoronadtlenek. Tworzący się z niego rodnik alkoksylowy może przekształcić się w hydroksylowaną przy węglu α resztę aminokwasową lub może doprowadzić do fragmentacji łańcucha polipeptydowego. Obecność rodnika alkoksylowego sprzyja fragmentacji łańcucha polipeptydowego. Do rozszczepiania wiązania peptydowego może dojść na drodze α-amidacji lub diamidacji. Powstający podczas α-amidowej fragmentacji N-końcowy peptyd, w C-końcu ma grupę amidową, natomiast drugi peptyd zawiera w N-końcu pochodną N-α-ketoacylową. Fragmentacja na drodze diamidowej charakteryzuje się powstaniem N-końcowego peptydu zawierającego strukturę diamidową i peptydu pochodzącego z C-końca cząsteczki białka zawierającego w N-końcu strukturę izocyjanianiu.
Bibliografia
1.Murray R. K., Granner D. K., Mayes P. A., Rodwell V, Biochemia Harpera. 1995; Wydawnictwo Lekarskie PZWL
2.Jakubke H. D., Jeschkeit H, Aminokwasy peptydy białka. 1982; Państwowe Wydawnictwo Naukowe
4.Kołodziejczak A, Aminokwasy i peptydy. 2006